一株鸭源H10N5亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

张元成，崔鹏飞，韩舒雨，薛振宇，谷文丽，刑 鑫，余兴龙，邓国华*，陈化兰

(1.湖南农业大学，湖南 长沙410128；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150069)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正粘病毒科A 型流感病毒属，根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同可分为多个不同的亚型，已发现的AIV 有16 个HA 亚型和9 个NA 亚型，而H10 亚型AIV 涵盖了9 种不同NA 亚型[1]。H10 亚型AIV 最早于1949年在德国发病鸡群中分离得到病毒株A/chicken/Germany/N/1949 (H10N7)，后 来H10 亚 型AIV 相继在世界的多个国家和地区的野鸟和家禽中均被分离报道[2]。1984年，瑞典首次报道了H10N4亚型AIV 跨物种间传播感染雪貂事件，引起大量雪貂死亡[3]。2009年～2010年，国内不断有分离到H10 亚型AIV 的报道，感染性实验结果表明该亚型病毒在家禽肾脏具有较高的复制能力[4]。2013年，我国报道了全球首例人感染H10N8 亚型AIV 病例，截止目前已有3 人感染，其中2 人死亡[5]。这些事件表明H10 亚型AIV 有跨越种间屏障感染哺乳动物甚至人类的潜在威胁。2008年，湖北省报道从猪体内分离到H10N5 亚型AIV，而且该病毒的PB2 蛋白发生了D701N 哺乳动物适应性突变[6]。这是首次在中国湖北省报道H10N5 AIV 在自然条件感染哺乳动物的事件，所以凸现出对H10N5 亚型AIV 的生物学特性研究的重要性。2014年在对禽流感流行病学的监测中，本实验室分离到一株鸭源H10N5 亚型AIV，通过对其生物学特性的分析，能够进一步了解该亚型AIV 的进化来源及其对哺乳动物的感染性。

1 材料与方法

1.1 病毒株及实验动物 病毒株A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)由国家禽流感参考实验室分离、鉴定并保存；10 日龄SPF 鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司；EasyTaqDNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司，测序反应试剂盒Big Dye Terminator 3.1 购自美国ABI 公司。

1.3 病毒的纯化及EID50的测定 将A/duck/HuB/S1254/2014 (H10N5)病毒原液用PBS 经10 倍倍比稀释后，接种于9 日龄～11 日龄的SPF 鸡胚中，37 ℃孵化48 h 后于4 ℃过夜，收集含有最大稀释倍数、最高血凝价的鸡胚尿囊液，连续纯化培养3 代后10倍倍比稀释至10-4，按常规方法进行EID50测定。

1.4 病毒的全基因组序列测定与遗传演化分析 按照试剂盒说明书提取病毒RNA，按照反转录试剂盒说明反转录获得cDNA，以其为PCR 扩增模板，参照Hoffmann 等[7]的引物及反应条件，PCR 扩增该病毒的各基因组节段。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒纯化后，利用测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1 进行全基因序列测定。用DNAStar 软件拼接后，利用MEGA 5.0 软件绘制HA 和NA 基因的进化树。

1.5 小鼠的感染性试验 选取6 周龄体质量相近的BALB/c 雌性小鼠作为感染组和对照组。感染组的8只小鼠用干冰轻度麻醉后，每只小鼠鼻腔接种106EID50的病毒稀释液50 μL，对照组轻微麻醉后接种50 μL 磷酸盐缓冲液(PBS)。感染组接种3 d 后随机迫杀3 只小鼠，并按脑、鼻甲、脾脏、肾脏、肺脏的顺序无菌采集脏器，置于1 mL 含三抗(青霉素、链霉素、头孢)冰PBS 液中研磨、离心，取上清液10 倍倍比稀释后接种10 日龄鸡胚进行病毒滴定，剩余5 只小鼠与对照组小鼠连续观察14 d 并记录每天的死亡和体重变化情况。

2 结 果

2.1 鸭源H10N5 亚型AIV 的HA 基因序列分析分离的H10N5 亚型AIV 接种鸡胚，收集的尿囊液经RT-PCR 扩增获得A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)HA 基因全长1 686 bp，编码561 个氨基酸，HA 蛋白裂解位点为334PELMQGR↓GLF343，仅存在1 个碱性氨基酸，符合低致病性AIV 的分子特征。HA 蛋白含有5 个潜在的糖基化位点：其中29NGT31，45NAT47，306NLS308， 位 于 HA1 亚 基，422NWT424，494NNT496位于HA2 亚基。该病毒的HA 基因序列与NCBI 数据库中核苷酸序列同源率最高的病毒株为A/migratory/duck/Jiangxi/30246/2013(H10N5)，基因登录号为KP285893.1，同源率高达98.7 % (表1)。

表1 病毒株A/duck/HuB/S1254/2014 (H10N5)各个基因节段BLAST 分析结果Table 1 Blast analysis of each segment of strain A/duck/HuB/S1254/2014 (H10N5)AIV

遗传演化结果显示，该病毒的HA 基因属于欧亚分支的JX346-Like-sublineage 谱系，与江西地区流行的H10N7、H10N8 亚型AIV 亲缘关系较近，但与湖北最早报道的A/swine/Hubei/10/2008(H10N5)病毒的HA 基因亲缘关系相差较远，其同源率仅为88.4%(图1)。该病毒中与HA 受体结合的相关氨基酸位点分别为151W、183H、186S、190E、191K、194L、226Q、227S、228G、229R，表明其可能主要表现为禽源受体结合的特性。

2.2 鸭源H10N5 亚型AIV 的NA 基因序列分析病毒株A/Duck/HuB/S1254/2014(H10N5)的NA 基因全长1 416 bp，编码472 个氨基酸，其潜在糖基化位 点 有6 个：46NTT47、51NET53、64NNT66、82NNT84、142NNT144、399NWS401。其NA 基因序列与NCBI 数据库中同源性最高的病毒株为A/migratory duck/Jiangxi/30246/2013(H10N5)(KP284879.1)，同源率高达99.1%，并未发现抗神经氨酸酶抑制剂的相关氨基酸位点H275Y 和对小鼠致病力增强K110E 和S453I 的氨基酸位点突变[8]。NA 基因遗传演化结果显示，与早期报道的湖北猪源分离株A/swine/Hubei/10/2008 (H10N5)的NA 同源性相差较远，而与江西野鸟源参考株的同源性较高(图2)，表明该病毒的表面基因可能来源于同一病毒株，而且野鸟对该病毒的流行起着重要作用，很可能为其它亚型的AIV 基因重组提供基因节段。

图1 A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)分离株HA 基因进化树Fig.1 The phylogenetic tree based on the hemagglutinin (HA)gene of A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)

图2 A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)分离株NA 基因进化树Fig.2 The phylogenetic tree based on the hemagglutinin (NA)gene of A/Duck/HuB/S1254/2014(H10N5)

2.3 鸭源H10N5 亚型AIV 的内部基因序列分析该病毒的PB2 和PA 基因序列与NCBI 数据库中病毒株A/migratory duck/Jiangxi/30246/2013(H10N5)的核苷酸序列具有最高同源性，结果进一步表明，该病毒与江西野鸟源病毒株A/migratory duck/Jiangxi/30246/2013(H10N5)亲缘关系密切，但是该病毒的PB1 基因、NP 基因、M 基因、NS 基因均与不同亚型AIV 的相应基因序列具有较高的相似度，表明该病毒基因来源的多样性(表1)。内部基因序列推导氨基酸分析结果显示，PB2 并未发现增强聚合酶活性和对小鼠毒力增加的相关氨基酸位点E158G、A558V、E627K、M631L 和D701N 的突变；PB1 中未发现Y436H 与毒力相关的氨基酸位点的替代；PA 在并未发现T515A 与病毒复制和决定宿主的相关氨基酸位点的取代；M 蛋白中抗金刚烷胺的关键氨基酸位点并未发现V27A 和S31N 的突变[9]。但是NS1 蛋白中存在与小鼠致病性增强相关的分子特征42S 和149A[10]，表明H10 亚型AIV 对哺乳动物存在一定的致病力。

2.4 H10N5 亚型AIV 对BALB/c 小鼠的感染性试验以106EID50的病毒剂量人工感染BALB/c 小鼠，小鼠未表现出任何的临床症状和明显的体质量下降，表明该病毒对小鼠呈低致病性(图3)。脏器滴定结果显示：分离株H10N5 能够在小鼠鼻甲和肺脏中有效复制，病毒滴度分别为4.08 log10 EID50/mL、5.0 log10 EID50/mL，而在小鼠的脑、脾、肾脏中均未检测到该病毒(图4)，表明H10 亚型AIV 具有感染哺乳动物的潜在风险。

图3 小鼠人工感染病毒后体重变化情况Fig.3 Weight change of mice after inoculated with the H10N5 AIV

图4 感染3 d 后BALB/c 小鼠脏器滴定结果Fig.4 Virus titration in mice organs at 3 days post infection

3 讨 论

本实验室分离的H10N5 亚型A/duck/HuB/S1254/2014(H10N5)进化关系表明，其HA 基因与之前报道的从猪中分离的A/swine/Hubei/10/2008(H10N5)株同源关系较远，所以其与该猪源病毒(H10N5)发生基因重组的可能性较小。该病毒的HA 基因位于JX346- Sublinage 谱系[4]，而NA 基因与江西地区流行的野鸟源病毒A/migratory duck/Jiangxi/30246/2013(H10N5)也存在较近的亲缘关系，所以推测该分离株的HA 基因和NA 基因最有可能来自江西地区，而曾经报道感染人的H10N8 亚型的AIV 也分离自江西地区，所以它们存在一个较近的同源关系，但是该病毒内部基因也存在与其它不同亚型毒株之间的较高同源性，推测这可能是一个重组病毒株。从该毒株进化关系的宿主来源分析，野鸟在该病毒的传播过程中起重要的作用，此外作为与野鸟密切接触的鸭群可能为该病毒的重组提供可能，使该病毒能够在家鸭中不断流行和重组，并且可能为其它亚型AIV 的重组提供可能[11]。2014年～2018年，本实验室零星分离到该亚型的病毒，大部分病毒株的HA基因位于JX346-Sublinage 谱系，但是该病毒同时也出现了新的分支。该病毒HA 裂解位点虽然仅存在1 个碱性氨基酸，但也可能对禽类表现出高致病力，这种高致病力可能与其内部基因的作用有关[12]。小鼠感染性试验结果显示，H10N5 亚型AIV 能够在小鼠的肺脏和鼻甲有效复制，表明其有感染哺乳动物的潜在风险，但并未引起小鼠明显的临床症状，表明其对哺乳动物呈低致病性，而且有相关研究报道H10N5 亚型AIV 在小鼠中传3 代就能够使小鼠致死[13]，HA蛋白的G218E和PB2蛋白的E627K或者D701N突变，其毒力会明显增强[14]。对H10 亚型AIV 的监测和生物特性的研究能够为我国禽流感的监测预警以及疫情防控提供数据支持。