快速测定乳制品中黄曲霉毒素B1、M1
2019-04-01李江黎丁滔綦艳严家俊邱启东佘之蕴
李江，黎丁滔，綦艳，严家俊，邱启东，佘之蕴
（广东产品质量监督检验研究院,广东佛山528300）
0 引 言
黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，从其化学结构和产生衍生物的不同并经鉴定的约20种，其中AFB1、B2、G1、G2、M 1、M 2等危害性较大[1-2]。黄曲霉毒素 B1(AFB1)，分子量：312.3，分子式：C17H12O6，与致癌有关[3-4]。黄曲霉毒素M 1(AFM 1)是黄曲霉毒素B1(AFB1)的羟基化代谢产物，其外观为白色或微黄色粉末，分子式为C17H12O7,分子量为328.3[5-6]，该毒素由Alleroft首先在牛奶中发现[7-8]，并命名为黄曲霉毒素M(Aflatoxin M)，主要有M 1和 M 2两种，有致癌性[9-11]。由于AFB1，AFM 1都具有强致癌性，建立一种快速、准确的检测方法具有重要意义，现对AFBI、AFM 1的检测方法有薄层色谱法TLC（Thin Layer Chromatograph）[12-14]、高效液相色谱法HPLC(High Performance Liquid Chromatography)[15-20]、液相色谱-质谱联用法HPLC-MS/MS(High performance liquid chromatography mass spectrometry/massspectrometry)[21-22]、ELISA（Enzyme-linked Immunosorbent Assay）法等[23-25]，薄层色谱法只能定性且操作步骤繁琐；高效液相色谱法和液质联用法前处理复杂，检测成本高，需要大型检测设备；而ELISA法、操作步骤简单、结果准确，检测成本较低，适合不同样本快速筛选及检测，已广泛应用于食品检测、分析化学等领域[26-28]，新颁布实施的GB5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定和GB 5009.24-2016食品中黄曲霉毒素M族的测定[29-30]，也将此法列入其中。
1 材料与方法
1.1 试剂
甲醇，批号：20161028，天津大茂化学试剂厂提供；纯水。
1.2 仪器与材料
MULTISKAN MK3酶标仪（Thermo），离心机（Sigma），电子天平(TIANFU)。
检测样品为牛奶，盒装液体，市售，产品批号：20180517；AFB1、AFM 1标 准 品（sigma），批 号 ：20161206；AFB1、AFM 1质控品（中国检科院），批号：20161122；AFB1、AFM 1 ELISA试剂盒，（江苏美正生物技术有限公司）批号：20170927。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
称取5.0±0.2 g样本到三角瓶中，加入25.0 mL，60%的甲醇-水，样品稀释5倍，涡旋混匀放在振荡器上振摇15.0 min，将混合液放入50.0 mL离心管中，6 000 r/min离心2.0 min，用滤纸过滤；取1 mL滤液到5.0 mL试管，加入4mL纯水稀释，总稀释倍数25倍，待测。
1.3.2 样本中AFB1、AFM 1的检测
将试剂盒从冰箱取出，在室温环境平衡60 min，按照试剂盒操作说明书，依次加入100μL AFB1标准品和样本到微孔中，再加入50μL/孔AFB1酶标物、抗试剂，混匀，避光，于室温环境孵育15min；孵育结束，倒掉微孔中的反应液，用250μL/孔洗涤液洗3～5次，接着在纸巾上拍打，去除洗涤液；加入100μL/孔显色液，混匀，避光，于室温孵育5～7 min；孵育结束，加入100μL/孔终止液，于450 nm波长处测定吸光度值。（AFM 1的样本检测和具体操作步骤同AFB1）
1.4 结果分析
用分析软件（Rida soft）对检测结果统计分析。
2 结果与分析
2.1 AFB1回收率结果
按试剂盒操作说明，取阴性质控品，分别添加0.2 μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三个浓度标准品，计算回收率，结果见表1。
表1 AFB1回收率结果
从表1测定结果中可知：当加标浓度为0.2μg/kg时，回收率为105.0%；加标浓度为0.4μg/kg时，回收率为110.0%；加标浓度为0.8μg/kg时，回收率为103.8%；回收率结果均在50%～120%范围，符合国标对回收率的要求。
2.2 AFM 1回收率结果
按试剂盒操作说明，取阴性质控品，分别添加0.2μg/kg，0.4μg/kg和0.8μg/kg三个浓度标准品，计算回收率，结果见表2。
从表2测定结果可知：当加标浓度为0.2μg/kg时，阴性样品的回收率为100.5%；加标浓度为0.4μg/kg时，阴性样品回收率为99.2%；加标浓度为0.8μg/kg时，阴性样品的回收率为101.5%；3个标准浓度回收率均在50%～120%范围，符合国标中对回收率的要求。
2.3 方法检出限
表2 AFM1回收率测定结果
对10份阴性样本进行检测，计算AFB1、AFM 1的含量，方法的检出限等于阴性空白样本的检测平均值加上阴性样本检测浓度的3倍标准偏差，结果见表3。
表3 AFM1方法检出限结果（n=10）
3 结论
建立了一种快速检测乳制品中AFB1、AFM 1的方法，AFB1的回收率分别为：98.7%、97.3%及103.6%；AFM 1的回收率为：100.5%、99.2%及101.5%；方法检出限为0.03μg/kg。检测方法快速、简单、准确且灵敏度高，适用于对乳制品中AFB1、AFM 1的快速检测。
