液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿配方乳粉中六种消毒剂残留

2019-04-01王浩陈江龙张杉赵丽张旭

中国乳品工业 2019年1期

王浩，陈江龙，张杉，赵丽，张旭

（国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094）

0 引言

婴幼儿配方乳粉是通过添加营养成分，使其组成在数量上和质量上无限接近母乳的营养元素为目标的的调制乳粉。婴幼儿配方乳粉消费比例逐年增加，所以其安全问题备受广泛关注。苯扎溴铵、C12-苯扎氯铵、C14-苯扎氯铵、C16-苯扎氯铵、二癸基二甲基氯化铵、四丁基硫酸氢铵都是常用的消毒剂，乳粉生产企业在生产环节及原料乳中有时会存在残留，从而造成婴幼儿营养乳粉中存在上述消毒剂污染；目前，国家还没有婴儿配方奶粉中消毒剂残留的限量标准，为了保护广大婴幼儿的健康和利益，对婴幼儿配方乳粉中消毒剂残留进行监控有着重要的现实意义。

目前，测定苯扎氯铵等六种消毒剂的方法有示差分光光度法[1]、毛细管电泳法[2]、液相色谱法[3-7]、液相色谱串联质谱[8]等。液相色谱-质谱联用技术是近年来新兴的检测技术,由于其对痕量残留物质强大的定性定量能力,符合目前食品安全检测所追求的快速高效定性定量测定要求,目前还未见对婴儿配方奶粉中苯扎溴铵、C12-苯扎氯铵、C14-苯扎氯铵、C16-苯扎氯铵、二癸基二甲基氯化铵、四丁基硫酸氢铵等六种消毒剂残留同时定性定量检测的研究报道。本文采用水超声溶解，乙腈除蛋白，基质外标法定量，采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测,前处理简单，灵敏度高，能够为婴儿配方奶粉中多种消毒剂残留的监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与试剂

1.2 主要仪器与设备

液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，美国Agilent公司；涡旋混合器，海门市其林贝尔公司；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；离心机，上海安亭科学仪器厂；去离子水发生器，瑞士Millipore公司。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备液

分别称取适量的苯扎溴铵、C12-苯扎氯铵、C14-苯扎氯铵、C16-苯扎氯铵、二癸基二甲基氯化铵、四丁基硫酸氢铵标准品，分别用甲醇配成0.1 mg/mL的标准储备液，该溶液在-18℃保存，有效期一年。

1.3.2 中间浓度标准溶液

用甲醇将标准储备液稀释成1.0μg/mL，该溶液在2～8℃保存，有效期三个月。

1.3.3 标准工作溶液

用甲醇将中间浓度标准溶液配制成苯扎溴铵、C12-苯扎氯铵、C14-苯扎氯铵、C16-苯扎氯铵、二癸基二甲基氯化铵、四丁基硫酸氢铵浓度均为50 ng/mL的标准工作液，该溶液在2～8℃保存，有效期一周。

3)在加木垫板后，锚杆支护预应力场压应力区峰值和压应力扩散范围都出现明显降低。应力峰值降低38%，-0.10、-0.08、-0.02 MPa等各应力等值面面积平均降低27%。

1.3.4 基质标准工作液

称取约1.0 g阴性样品,精确至0.01 g，置于10 mL玻璃离心管中，分别加入标准工作液：10μL、20μL、40μL、100μL、200μL，余下操作同1.3。

1.4 样品处理

称取1.0 g样品,精确至0.01 g，置于10 mL具塞比色管中，加入2 mL 60℃～70℃热水，涡旋30 s后，再加入3 mL乙腈，具塞振摇使蛋白质沉淀，超声提取10 min，吸取1 mL上清液4℃条件下15 000 r/min离心5 min，液相色谱-串联质谱测定。

1.5 仪器参数

1.5.1 色谱参数

色谱柱：Hypersil GOLD C18柱，4.6 mm×50 mm,1.9μm；流速：0.35 mL/min；柱温25℃，进样量3μL，流动相：20 mmolL乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸）+甲醇=10:90，V/V。

1.5.2 质谱参数

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2；雾化气压力310 kPa；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10 L/min。

表1 六种消毒剂的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

乳粉基质复杂，富含脂肪和蛋白质，所以本方法在样品中先加入2 mL水，涡旋1 min，使样品中目标化合物充分溶解，再加入3 mL乙腈，去除样品中蛋白质。此外，因为消毒剂残留可能存在环境污染，所以不易做除油和过膜处理，最终采用4℃条件下15 000 r/min后直接进样。这种前处理的方法简便快速，既能充分提取样品中苯扎溴胺等六种消毒剂残留，又能除去样品中的蛋白质，定量限均为0.5μg/kg，平均加标回收率＞85%，可以完全满足实际检测要求。

2.2 仪器条件

2.2.1 色谱柱的优化

为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,1.8μm)、Hypersil GOLD C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,1.9μm)和Agilent Extend-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,5μm)进行分离试验，发现Hypersil GOLD C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,1.9μm))峰形及出峰时间较为合适。

2.2.2 流动相

苯扎溴胺等六种消毒剂极性相差很大，首先考虑用梯度洗脱的方式实现目标化合物的有效分离，但是随后的实验发现C16-苯扎氯铵会出现假阳性情况，因此确定等度洗脱的流动相。分别比较了20 mmolL乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸）-乙腈、10 mmolL乙酸铵水溶液-乙腈、水-乙腈等三种体系，发现后两种体系C12-苯扎氯铵、C14-苯扎氯铵、C16-苯扎氯铵会出现不同程度的峰形展宽，灵敏性降低。所以本实验选择20mmolL乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸）-乙腈=10:90，V/V。

2.3 方法学结论

2.3.1 基质工作曲线、检出限、定量限

乳粉富含油脂蛋白质，为了消除测定液中存在的基质效应，本方法首先在前处理过程中采取除油和除蛋白处理，同时采用空白样品加标法配制的基质工作曲线，极大程度消除测定中的基质效应，同时又明显提高了定量的准确性。用基质标准工作液分别进样3μL，测定结果经线性回归（y为峰面积，Counts；x为浓度，μg/L），同时用空白样品进行加标实验，在信噪比均大于3的条件下能检出，将此添加量定为检出限，在信噪比均大于,10的条件下能检出，将此添加量定为定量限。结果见表2。

表2 六种消毒剂的线性方程、线性关系、相关系数及检出限

2.3.2 方法的回收率和精密度

选取空白样品进行回收率和精密度试验。每组分别定量加入苯扎溴胺等六种消毒剂标准品，添加水平分别为0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg，按供试品溶液制备方法制备后进行测定,结果见表3。按供试品溶液制备方法制备后进行测定,结果见表3。从表3中可看出，不同浓度平均加标回收率87.3%～104.6%，平均相对标准偏差为2.96%～9.87%（n=6）。图1为加标样品中MRM色谱图。

表3 加标样品回收率与相对标准偏差（n=6）

图1 苯扎溴胺等六种消毒剂的加标MRM色谱图

2.4 实际样品检测

利用本方法对市场销售的50种婴幼儿营养乳粉进行检测，其中32个样品检出C12-苯扎氯铵（浓度范围为0.63μg/kg-50.7μg/kg，检出率64.0%），6个样品检出C14-苯扎氯铵（浓度范围为0.56μg/kg-2.39μg/kg，检出率12.0%），2个样品检出四丁基硫酸氢铵（浓度分别为0.56μg/kg和2.30μg/kg，检出率4.0%），1个样品检出二癸基二甲基氯化铵（浓度为22.6μg/kg，检出率2.0%），苯扎溴铵和C14-苯扎氯铵未检出。上述结果表明，婴幼儿营养乳粉中确实存在消毒剂残留，其对婴幼儿健康存在的风险应当引起国家监管部门及婴配生产企业重视。