对 《中国药典》中侧柏叶TLC鉴别方法的改进

石典花， 宗珊珊， 胡 军， 戴衍朋， 张 军， 孙立立∗， 张学兰∗

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.山东省中医药研究院，山东 济南250014；3.山东省中医药研究院附属医院，山东济南250014）

侧柏叶为柏科植物侧柏 Platycladus orientalis（L.）Franco的枝梢及叶，大多在夏、秋二季采集，其味苦、涩，性寒，具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发之功效，主要用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白［1］，全国大部分地区均有生产［2］。它主要含有挥发油［3-4］、 黄酮［5-6］、 鞣质［7-8］等多种成分， 具有止血［9-10］、 抗 炎［11］、 抗菌［12］、 抗 氧化［13-14］、 抗 肿瘤［15］、防脱发［16］等作用。

目前，中药理化鉴别方法主要包括荧光法、微量升华法、显色、沉淀、泡沫反应、钙盐、钠盐、TLC法等，其中TLC法处理简单，成本低，可同时对多个成分进行比较，不需使用复杂仪器，应用范围最广泛。侧柏叶中主要有效成分为槲皮苷等，但由于其分子量较大而难以分离，其TLC鉴别一直是方法学研究的难点，故2015年版 《中国药典》中将其酸水解生成苷元槲皮素后再进行鉴别，但该方法涉及索氏提取步骤，至少需6 h，而加热回流需1 h，因此存在操作繁琐、耗时长、有机试剂用量多、成本高等缺点，无法满足实际应用中高效、简便的需求，而且目前尚无直接以槲皮苷为对照品的侧柏叶TLC鉴别方法。因此，本实验一方面对药典提取条件进行改进，使得鉴别时间大大缩短；另一方面直接以槲皮苷为对照品进行鉴定，以期达到直接用于侧柏叶TLC鉴别方法的目的。

1 材料

1.1 仪器 WFH-201B型紫外仪 （上海精科实业有限公司）；XMT804型电热恒温水浴锅 （上海医疗器械五厂）；DHG-9146型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司）；LC-350A型超声波中药处理机 （济宁市中区鲁超仪器厂）；圆底烧瓶、具塞锥形瓶、漏斗、分液漏斗等。

1.2 试药 侧柏叶采自济南燕子山、南部山区、千佛山、临沂费县，经专家鉴定为正品，自然阴干。槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号00819304）；槲皮苷对照品 （成都普瑞法科技开发有限公司，批号16022001）；硅胶G薄层板 （自制）。甲醇、乙酸乙酯、盐酸、甲苯、甲酸、乙醇等均为分析纯；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 原药典法 取药材粉末3 g，置索氏提取器中，加适量乙醚加热回流至提取液无色，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，加70%乙醇50 mL，加热回流1 h，趁热滤过，滤液蒸干，残渣加 25 mL水溶解，加 3 mL盐酸，加热水解30 min，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取 2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次10 mL，水浴蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；取槲皮素对照品适量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg该成分的溶液，作为对照品溶液。按照2015年版 《中国药典》四部通则0502，吸取供试品、对照品溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 （5∶2∶1）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯 （365 nm）下检视，结果见图1。由图1可知，供试品色谱在对照品相应位置上显相同颜色荧光斑点，而且其清晰、分离度良好。

图1 侧柏叶TLC色谱图 （原药典法）

图2 侧柏叶TLC色谱图 ［改进药典法 （以槲皮素为对照品）］

2.2 改进药典法 （以槲皮素为对照品） 针对原药典法中提取耗时长、步骤繁琐的问题，本实验建立省去索氏提取而直接回流水解的方法。取药材粉末3 g，置锥形瓶中，加水25 mL、盐酸3 mL，水浴加热回流30 min，趁热滤过，滤液置分液漏斗中，加25 mL乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层水洗3次，每次10 mL，水浴蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；取槲皮素对照品适量，加乙醇制成0.1 mg／mL溶液，作为对照品溶液。按照2015年版 《中国药典》四部通则0502，吸取供试品、对照品溶液各3 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 （5∶2∶1）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯 （365 nm）下检视，结果见图2。由图2可知，各批药材在槲皮素对照品相应位置上均显相同颜色荧光斑点。

2.3 改进药典法 （以槲皮苷为对照品） 原药典法是将侧柏叶中槲皮苷酸水解生成槲皮素后进行鉴别，本实验建立不水解而直接鉴别侧柏叶中槲皮苷的方法。取药材粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加20 mL 70%甲醇超声30 min，过滤，滤液水浴蒸干，残渣加2 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；取槲皮苷对照品适量，加乙醇制成0.1 mg／mL溶液，作为对照品溶液。按照2015年版 《中国药典》四部通则0502，吸取供试品、对照品溶液各3 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水 （12∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝-乙醇溶液，置紫外光灯 （365 nm）下检视，结果见图3。由图3可知，各批药材在槲皮苷对照品相应位置上均显相同颜色荧光斑点。

图3 侧柏叶TLC色谱图 ［改进药典法 （以槲皮苷为对照品）］

3 讨论

现行 《中国药典》中侧柏叶鉴别方法为将其叶绿素成分用索氏提取器提取后，再对其黄酮类成分槲皮苷酸水解生成槲皮素，接着用乙酸乙酯萃取、水洗、浓缩。基于上述水解原理，本实验建立的第1种方法是省去耗时较长的索氏提取步骤，将侧柏叶水解后直接萃取，也可达到有效去除叶绿素、水解槲皮苷、富集槲皮素的目的，较原药典法更省时省力、简便快速。

考虑到侧柏叶中含槲皮苷，不含槲皮素，本实验尝试建立1种不水解而直接以槲皮苷为对照品的鉴定方法。首先，分别对甲醇加热回流1 h、超声1 h、超声30 min等提取条件进行筛选，样品量从3 g降到1 g，最终确定为样品量1 g，超声提取30 min。其次，考察以乙醇-丙酮-水 （7∶5∶6）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸 （7∶5∶0.8）、 乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1）等药典收载的黄酮类成分展开系统，发现乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1）展开效果较好。接着，比较不同比例乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1、10∶1∶1、12∶1∶1、 14∶1∶1）， 最终确定在12∶1∶1比例下斑点分离度良好，显色清晰。该方法较以槲皮素为对照品更高效快捷，而且槲皮苷是侧柏叶中原有成分，不需要再酸水解生成槲皮素，直接超声30 min即可进行TLC鉴别，不仅可大大提高鉴别效率，还能节约药材和试剂。

综上所述，本实验建立了2种快速简便的侧柏叶TLC鉴别方法，1种以原药典法为基础，通过改进提取方法达到快速鉴别的目的；另1种直接以侧柏叶中原有成分槲皮苷为对照品，两者较原药典法均可节省80%以上时间，操作简便，斑点清晰，而且均能达到高效、快速、简便的TLC鉴别目的，其中又以后者更高效合理。基于此，建议新版 《中国药典》修订侧柏叶TLC鉴别方法。