槐花散中侧柏叶的遵古炮制及现代炮制方法比较研究

于浩，包永睿，2，3，王帅，2，3，李天娇，2，3，孟宪生，2，3*（. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连6600；2. 辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3. 辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连6600）

经典名方遵古开发相关研究已成为研究热点，已有较多文献从本草考证、制剂工艺、专利研究等方面展开相关研究。但有关经典名方中具体中药炮制方法的研究鲜有报道。本课题组在“遵从经典，符合药典”的原则下，采用性状鉴别、浸出物含量、化学成分、指纹图谱相似度评价等多种分析方法比较经典名方槐花散中侧柏叶古法炮制与现代炮制方法的异同点，结合多波长融合指纹图谱，从化学成分方面验证古今炮制方法的异同。

槐花散由炒槐花、焙侧柏叶、荆芥穗、麸炒枳壳组成，具有疏风利气、清肠凉血的功效，主治肠风脏毒下血、痔疮出血、脱肛属风邪热毒或湿热等病症[1]。经方组成中侧柏叶起凉血止血之功效，侧柏叶药材的基原与药用部位与2020年版《中国药典》收载品种相同，选用柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和叶，多在夏、秋二季采收，阴干[2]。侧柏叶最早记载于《神农本草经》，微寒，能凉血止血、清热止咳、祛风利湿、散肿毒、生发乌发[3]。焙是古代炮制方法之一，将药物置于器皿中，用文火经较短时间加热至药物颜色加深、质地酥脆为度。焙制侧柏叶在《圣济总录》和《普济方》中皆有记载[3-4]。本研究还原古籍中记载，以焙制侧柏叶为基准，采用烘制方法，比较烘制侧柏叶与焙制侧柏叶的异同点。

1 材料

1.1 试药

侧柏叶药材（上元堂药房，产地为安徽省，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为柏科植物侧柏的干燥枝梢和叶）。乙腈、甲酸、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），水为超纯水。

1.2 仪器

2 L 陶瓷药罐（壶福有限公司）；1260 InfinityⅡ型超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和 OpenLAB CDS色谱工作站）；LY15-101-2电热恒温干燥箱（上海龙跃仪器有限公司）；JX-2020小型珠磨仪（上海净信有限公司）；KQ5200V超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 不同炮制方法样品性状鉴别

2.1.1 焙制侧柏叶的制作 取干燥后侧柏叶，除去硬梗及杂质，置于陶瓷药罐内，用文火加热，至罐中侧柏叶颜色变深，质地酥脆，有香气散出。取出，晾干，得侧柏叶焙制样品（见图1）[4-6]。

图1 不同炮制方法的侧柏叶性状鉴别Fig 1 Characteristics of cacumen platycladi by different processing methods

2.1.2 烘制侧柏叶的制作 取干燥后侧柏叶，除去硬梗及杂质，置于烘箱中，采用均匀设计法，烘箱温度为120、140、160、180℃，烘制时间为10、15、20 min。取出，晾干，得不同条件下侧柏叶烘制样品。

2.1.3 性状鉴别及浸出物含量测定 对不同炮制方法的侧柏叶样品进行性状鉴别和浸出物含量测定。按2020年版《中国药典》规定方法，照醇溶性浸出物测定法下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，测定不同炮制侧柏叶样品的浸出物含量，结果见表1。

表1 不同炮制方法样品的鉴定Tab 1 Identification of samples of different processing methods

2.2 侧柏叶UPLC指纹图谱的建立[7-8]

2.2.1 色谱条件 Agilent Proshell 120 SB-C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），A为0.1%甲酸水，流动相 B为乙腈，梯度洗脱条件（0～2 min，5%～15%B；2～6 min，15%～18%B；6～18 min，18%～38%B；18～21 min，38%～54%B；21～27 min，54%～64%B；27～30 min，64%～85%B），进样量5 μL，流速0.6 mL·min－1，柱温30℃。

2.2.2 供试品溶液的制备 取炮制后侧柏叶粉末约0.5 g，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液20 mL，超声处理20 min，用甲醇补足失重，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 仪器精密度试验 取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果各色谱峰相对保留时间RSD＜0.1%，相对峰面积RSD＜1.5%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性试验 取相同炮制方法的侧柏叶供试品溶液6份，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果各共有峰相对保留时间的RSD均＜0.1%，相对峰面积RSD均＜1.5%，表明方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取供试品溶液，室温下放置0、2、4、6、12、24 h分别按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果各共有色谱峰相对保留时RSD＜0.1%，相对峰面积RSD＜1.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.6 多波长融合侧柏叶的UPLC指纹图谱的建立 选取140℃烘制样品与焙制样品，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，共确认了21个共有峰。通过DAD检测器对侧柏叶色谱图进行紫外全波长（200～400 nm）扫描。根据扫描结果确定融合波长为254、280、300 nm。分别从Agilent 1260色谱工作站中导出254、280、300 nm的dif格式数据文件，使用Matlab软件编程，将导出的数据进行全时段多波长信息融合后，比较得出焙制侧柏叶与烘制侧柏叶在色谱图上无显著性差别，结果见图2。

图2 侧柏叶焙制品（S1：B1、B2、B3混合样品）与烘制品（S2：H1、H2、H3混合样品）多波长融合的UPLC指纹图谱Fig 2 UPLC multi-wavelength fusion fingerprint of cacumen platycladi baked product（S1：B1，B2，B3 mixed samples）and dried product（S2：H1，H2，H3 mixed samples）

2.3 不同炮制方法的侧柏叶样品同异性分析

将不同炮制方法的侧柏叶共有峰峰面积数据导入SIMCA-P 14.1中进行无监督模式的PCA-X，获得相应的模型，模型参数R2X（在 X 轴方向模型的解释率）为0.748，Q2（模型预测率）为0.649，均＞0.5，表明该模型稳定可靠，见图3。结果表明3批焙制侧柏叶处在同一区间，且相邻距离很小，焙制侧柏叶样品稳定性较好；不同烘制侧柏叶处在不同区间，表明烘制侧柏叶样品随不同烘制温度受热具有一定变化，可能与侧柏叶的寒凉性有关。通过PCA-X判别可以直观地显示不同炮制方法侧柏叶样品之间的异同性，其中与焙制侧柏叶最相近的烘制侧柏叶方法为“2.1.3”项下H5条件（即140℃烘制15 min）。

图3 不同炮制方法的侧柏叶共有峰PCA-XFig 3 Lateral cypress PCA-X of cacumen platycladi by different processing methods

2.4 两种炮制方法相似度评价

为了验证烘制侧柏叶与焙制侧柏叶炮制方法的一致性，按照“2.1.3”项下H5条件制备10批样品（编号为HZ1～HZ10），按照B1条件制备10批样品的（编号为BZ1～BZ10），将所得样品的UPLC色谱图分别导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2014版）软件，设定参照图谱和时间漂移值0.2 min，用中位数法谱峰自动匹配，生成UPLC指纹图谱共有模式，即对照指纹图谱。结果烘制侧柏叶与焙制侧柏叶样品对照指纹图谱的相似度在0.96～0.99，说明烘制样品与焙制样品有较好的一致性，结果见图4。

图4 焙制侧柏叶对照指纹图谱（A）与烘制侧柏叶对照指纹图谱（B）Fig 4 Baked cacumen platycladi control fingerprints（A）and dried cacumen platycladi control fingerprints（B）

3 讨论

本研究对烘制与焙制的侧柏叶指纹图谱进行多波长融合，融合后的指纹图谱能够完整地表征侧柏叶的化学成分组成。运用主成分分析技术，将经典名方槐花散中古籍记载的焙制侧柏叶与现代炮制工艺烘制的侧柏叶进行分析，发现在140℃烘制15 min，得到的样品与焙制样品具有高度一致性。通过中药指纹图谱相似度评价系统，结果表明该条件下烘制侧柏叶与焙制侧柏叶的UPLC指纹图谱相似度均在0.96～0.99，且两种炮制方法生成的对照指纹图谱基本相同，进一步验证了现代烘制侧柏叶可以代替古籍中记载的焙制侧柏叶。

《古代经典名方关键信息考证原则》[9]中指出“信息考证在遵古的基础上充分考虑当前临床和生产实际，传承不泥古，用历史和发展的角度去认识经典名方中药物炮制等关键共性问题”。本研究在烘制侧柏叶过程中，利用烘箱、干燥室等使样品受热均匀，操作较为简单，炮制方法仅与仪器的温度、加热时间有关，不需要考虑火候及操作经验，只需要制订炮制标准即可，解决了焙制侧柏叶产量低、焙制火候难以控制、侧柏叶化学成分热不稳定性、焙制样品差异性对药效产生影响等问题。本研究发现不同烘制温度的侧柏叶样品之间具有明显差异，侧柏叶属寒凉类药物，其中的槲皮苷、异槲皮苷、杨梅苷等黄酮苷类均与寒凉之性明显相关[10-16]，研究表明侧柏叶随受热温度升高，穗花衫双黄酮、扁柏双黄酮含量下降，山柰酚、杨梅素含量增加[17-18]。

本研究表明用烘制侧柏叶代替古籍中记载的焙制侧柏叶，既遵从了古代炮制制药技术理念又便于控制炮制程度，既降低了劳动成本和炮制工艺的繁琐性又能复刻药效，体现了中药现代炮制方法的科学性。