鱼类C-型凝集素结构特征及其免疫功能

王 莉，张 杰，赵贤亮，狄桂兰，孔祥会

( 1.河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007；2.河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

1 鱼类C-型凝集素

C-型凝集素是最早被发现的动物凝集素之一。C-型凝集素家族成员胶固素在牛血清中最先被发现[26]。起初认为C-型凝集素是一类依赖Ca2+的糖结合蛋白。随着研究的深入，不同结构和功能的C-型凝集素被逐渐确定，发现并不是所有的C-型凝集素均依赖Ca2+。鱼类有些C-型凝集素发挥功能，并不依赖Ca2+ [13]。C-型凝集素的重要特征是具有糖识别结构域，且在糖识别结构域中存在高度保守的基序。晶体结构分析发现，C-型凝集素的糖识别结构域具有特殊的球状结构，而其他已知的蛋白中不存在该类型的结构域。因此，糖识别结构域的存在是判定其为C-型凝集素的标准[27-28]。目前一般认为，鱼类C-型凝集素是一类至少含有一个糖识别结构域的蛋白超家族。即使有些C-型凝集素并不能结合糖，但只要含有与糖识别结构域相似结构域的蛋白，均可称为C-型凝集素[29]。

2 鱼类C-型凝集素亚家族

Drickamer等[30]根据脊椎动物C-型凝集素的进化、结构及功能的相关性将其分为7个亚家族(Ⅰ～Ⅶ)。随着研究逐步深入，至2002年增加至14个亚家族(Ⅷ～ⅩⅣ)[31]。Zelensky等[32]基于红鳍东方鲀(Takifugurubripes)基因组相关研究又发现3个亚家族(ⅩⅤ～ⅩⅦ)。因此，脊椎动物C-型凝集素依据其结构域元件组成不同，可分为17个亚家族。Zelensky等[32]通过对红鳍东方鲀进行基因组测序及分析比对，发现红鳍东方鲀中含有与脊椎动物C-型凝集素相对应的15个亚家族，每个亚家族拥有与脊椎动物相同的成员，但未发现与脊椎动物C-型凝集素Ⅴ和Ⅶ亚家族相对应的成员。进一步通过序列比对和进化树构建，发现红鳍东方鲀C-型凝集素中的某些亚家族的成员，如硫酸软骨蛋白多糖家族成员，与脊椎动物相比高度保守。

3 鱼类C-型凝集素的蛋白结构特征

脊椎动物C-型凝集素蛋白晶体结构表明，糖识别结构域由110～130个氨基酸残基构成，具有独特的紧密球形结构[29]。该结构域含有双环结构(图1)，整体是1个由N-端和C-端2个β折叠(β1和β5)构成的反向平行的β-片层；第2个环状结构被称为“长环”区域，位于整个结构域的内部，延伸到核心区，是糖识别结构域与Ca2+和糖类结合相关的部位。2个环状结构的基部由4个高度保守的半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫键连接，其中C1和C4连接整体环状结构的β5和α1，C2和C3连接“长环”区域的β3和β5。其余肽段则形成两个侧翼的α螺旋结构(α1和α2)及第2个反向平行的β-片层(β2、β3和β4)[27]。采用SWISS-MODLE软件预测松江鲈C-型凝集素的三维结构，发现松江鲈C-型凝集素的糖识别结构域为双环结构的紧密球形结构(图2)。双环结构的基部由4个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫键连接；“长环”区域为糖识别结构域与Ca2+和糖类结合相关的部位。预测结构与脊椎动物C-型凝集素的蛋白晶体结构极其相似[16](图2)。氨基酸序列比对结果表明，许多鱼类C-型凝集素的糖识别结构域中均存在4个高度保守的半胱氨酸残基，形成的二硫键对于构建和稳固C-型凝集素的双环结构发挥重要作用[22,33]。

部分C-型凝集素的糖识别结构域在多肽链N-端含有1个功能未知的β-发夹结构，该结构由1对半胱氨酸残基(C0和C0′)形成的二硫键固定。据此将糖识别结构域分为两类：含有该β-发夹结构及半胱氨酸残基(C0和C0′)的糖识别结构域被称作“长型”糖识别结构域，而不含这对半胱氨酸残基的糖识别结构域被称为“短型”糖识别结构域[27,34-35]。“长型”糖识别结构域在斜带石斑鱼、松江鲈、香鱼(Plecoglossusaltivelis)及大黄鱼C-型凝集素中均有报道[11,16,18,22]。

图1 C-型凝集素的糖识别结构域三级结构[29]蓝色为“长环”区域，橙色棒状结构为半胱氨酸形成的二硫键.“长型”糖识别结构域的β-发夹结构(β1′)和二硫键(C0和C0′)均有显示.

图2 松江鲈C-型凝集素糖识别结构域的预测三级结构[16]

4 C-型凝集素糖识别结构域的Ca2+结合位点和关键基序与糖结合的特异性

X射线晶体学和位点突变等方法为研究糖识别结构域与糖结合机制提供了很大帮助，对多个C-型凝集素结构的分析发现，糖识别结构域含有4个Ca2+结合位点[29,38-39]。其中Ca2+结合位点2是C-型凝集素结合糖的重要部位。C-型凝集素对糖的识别活性和结合特异性主要取决于Ca2+结合位点2的质子供体和质子受体的位置。与Ca2+结合的氨基酸残基通过侧链的羰基与Ca2+和糖形成复合体，这些氨基酸残基构成了两组关键的氨基酸基序[29]。

以大鼠甘露糖结合蛋白A为例，第一组关键的氨基酸基序是谷氨酸—脯氨酸—天冬酰胺(EPN)。该基序位于“长环”结构区域，谷氨酸和天冬酰胺被脯氨酸分离并分布于同侧。谷氨酸和天冬酰胺通过与位于D-甘露糖赤道轴的3-OH和4-OH结合形成氢键，同时与Ca2+形成两个配位键[27]。在该位点上，还可存在另一种关键的氨基酸基序是谷氨酰胺—脯氨酸—天冬氨酸(QPD)，谷氨酰胺和天冬氨酸通过与D-半乳糖径向轴的3-OH和赤道轴的4-OH结合形成氢键，同样也能与Ca2+形成两个配位键。蛋白晶体结构学的研究表明，关键的氨基酸基序EPN或QPD并没有使Ca2+结合位点2的结构发生重大变化，变化的关键在于交换了与糖配体结合平面上的质子供体和质子受体的位置，进而将氢键的结合从非对称的甘露糖转换成了对称的半乳糖[40]。对多种C-型凝集素突变体结合特异性的研究表明，仅将C-型凝集素中关键的氨基酸基序EPN突变为QPD，就可改变凝集素的糖结合特异性[41]。

第二组关键的氨基酸基序是位于β4的色氨酸—天冬酰胺—天冬氨酸(WND)，其中天冬酰胺和天冬氨酸能与Ca2+相互作用，同时也能与糖的羟基形成氢键。而且色氨酸是一个非常保守的氨基酸残基，有助于疏水中心的形成。

5 鱼类C-型凝集素的免疫功能

C-型凝集素家族为一类重要的模式识别受体，通过识别微生物表面的糖类结构，引发凝集微生物、诱导吞噬、激活补体等过程[42-43]，并随着特异性免疫的出现而参与调节特异性免疫[44]。目前关于鱼类C-型凝集素免疫功能的研究进展及相关物种见表1。

5.1 C-型凝集素对病原相关分子模式的识别与结合

鱼类C-型凝集素通过其糖识别结构域识别与结合微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖类结构的病原相关分子模式。通过糖类抑制C-型凝集素对细菌凝集或红细胞凝集来间接反映C-型凝集素可结合的糖类；也可通过酶联免疫吸附试验直接检测C-型凝集素与糖类结构的结合能力。

2016年，自许氏平鲉中获得一种仅含一个糖识别结构域的C-型凝集素，可凝集鱼类病原菌肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)和创伤弧菌(V.vulnificus)。但在甘露糖存在的情况下，会抑制其对致病菌的凝集能力。因此，推测该凝集素可能是通过识别与结合甘露糖来实现对肠道弧菌和创伤弧菌的结合与凝集[23]。同年，大黄鱼中发现1种C-型凝集素蛋白，可广泛凝集革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)及溶藻弧菌(V.alginolyticus)。但在脂多糖存在的条件下，其凝集能力会减弱甚至消失。因此，推测此凝集素是通过识别革兰氏阴性菌表面的脂多糖进而凝集致病菌，从而抑制致病菌对鱼体的侵染[22]。

本课题组自淇河鲫鱼中克隆获得1种C-型凝集素，构建大肠杆菌表达载体获得其重组蛋白。酶联免疫吸附试验表明，该C-型凝集素的重组蛋白可与脂多糖及肽聚糖发生识别及结合作用，且对脂多糖的结合能力强于肽聚糖[33]。

5.2 C-型凝集素与红细胞或致病微生物的凝集作用

能够凝集红细胞是C-型凝集素的基本特征。多种鱼类的C-型凝集素能凝集人、家兔及鱼类的红细胞。有些C-型凝集素依赖Ca2+，才能发挥凝集红细胞的能力，有些则不需要。例如，从纳氏海蟾鱼(Thalassophrynenattereri)体内分离到1种C-型凝集素，具有不依赖Ca2+凝集人红细胞的能力[13]。而斜带石斑鱼C-型凝集素的重组蛋白必须在Ca2+存在的条件下才能凝集家兔红细胞[11]；大黄鱼中获得1种仅含单个糖识别结构域的C-型凝集素，在Ca2+存在的条件下，其重组蛋白能凝集人、家兔和大黄鱼的红细胞，对人和大黄鱼的红细胞凝集活性较强[22]。

除了可以凝集红细胞，鱼类C-型凝集素对大量的致病微生物，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌均能产生凝集作用。松江鲈C-型凝集素的重组表达蛋白在Ca2+存在条件下，既可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌、鳗弧菌(V.anguillarum)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)；还可以凝集革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensi)和真菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[16]。大黄鱼的C-型凝集素重组蛋白在Ca2+存在条件下，可凝集所有的受试微生物包括4种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌[22]。2015年，自半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)中克隆得到1个单糖识别结构域的C-型凝集素。该凝集素可凝集鳗弧菌和藤黄微球菌(Micrococcusluteus)。其糖识别结构域中的保守基序EPN若发生突变，就会失去凝集鳗弧菌和藤黄微球菌的能力[17]。因此，推测该凝集素保守基序在凝集致病菌中发挥了关键作用。综上所述，鱼类C-型凝集素通过对致病菌的识别与凝集，可以在一定程度上减弱致病菌对鱼体的侵袭与感染，也可以引发下游的免疫效应，如增强免疫细胞的吞噬能力，激活补体系统，清除体内病原菌等。

5.3 C-型凝集素可增强免疫细胞的吞噬能力

鱼类C-型凝集素可以增强巨噬细胞吞噬能力，激活中性粒细胞，刺激淋巴细胞的增殖，参与免疫调节。大菱鲆C-型凝集素可以刺激肾脏淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞对细菌的杀伤力[9]。斑马鱼甘露糖结合凝集素(1种C-型凝集素)能够促进鲤巨噬细胞对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用[45]。利用离子交换层析法，Lopesferreira等[13]从纳氏海蟾鱼体内分离到1个分子量仅为15 ku的C-型凝集素。体外试验发现，该凝集素可以激活小鼠(Musmusculus)的中性粒细胞，具有免疫调节功效。

在香鱼的头肾和外周血中鉴定获得1个跨膜的C-型凝集素受体，其可与白细胞衍生趋化因子2发生相互作用，推测该C-型凝集素受体可能通过与白细胞衍生趋化因子2的结合作用，影响中性粒细胞趋化作用而介导细胞免疫[18]。将白细胞衍生趋化因子2的重组蛋白加入香鱼的单核及巨噬细胞，结果单核及巨噬细胞中细胞因子的mRNA表达水平包括白介素-1β、白介素-10、肿瘤坏死因子-α及粒细胞集落刺激因子均显著增加；增强了单核及巨噬细胞对大肠杆菌的吞噬能力和杀伤能力。但是，若加入白细胞衍生趋化因子2重组蛋白的同时再加入抗香鱼C-型凝集素受体的抗体(封闭C-型凝集素受体的胞外区)，上述的单核及巨噬细胞中细胞因子的mRNA表达水平以及对大肠杆菌的吞噬能力和杀伤能力显著降低。说明香鱼的这种C-型凝集素受体介导了白细胞衍生趋化因子2对香鱼的单核及巨噬细胞的免疫调控作用[19]。

自许氏平鲉中鉴定得到的1种C-型凝集素可提高头肾中巨噬细胞对创伤弧菌的吞噬能力。在体试验证明，感染创伤弧菌的许氏平鲉经过该凝集素重组蛋白处理，与对照组(未经该凝集素重组蛋白处理)相比，肾脏中创伤弧菌的数量明显减少。说明许氏平鲉C-型凝集素具备明显的免疫调节机能，在宿主防御致病菌入侵过程中发挥了重要作用[23]。

5.4 激活补体途径

甘露糖结合凝集素作为C-型凝集素家族的一名特殊成员[46-47]，通过自身的糖识别结构域与微生物表面的糖基结合，活化甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶，进而激活补体系统[48-55]。

综上所述，甘露糖结合凝集素相关研究主要集中于基因克隆、组织表达、致病菌感染后的免疫响应及影响致病菌凝集和吞噬等方面。然而关于甘露糖结合凝集素与甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶是否可以结合，结合后如何激活补体系统启动先天免疫，仍需进一步深入研究。

表1 鱼类C-型凝集素的免疫功能

6 展 望

目前，鱼类C-型凝集素相关的研究主要集中于其对病原相关分子模式的识别与结合，引发致病菌凝集，增强巨噬细胞对致病菌的吞噬能力等方面。研究表明，病原菌感染鱼体后，鱼类C-型凝集素可发挥重要的免疫作用。今后应深入研究C-型凝集素增强鱼体免疫和防病的分子机制，探明C-型凝集素参与鱼体免疫和防病的机理，开发新型渔用抗菌剂，以有效防控鱼类细菌性疾病的发生。