液液萃取结合气质联用技术测定山药酒中萜烯类化合物

王晨慧，李春扬,2，张晓磊,2*，饶静,2，辛鹏,2，尹建军,2，宋全厚,2

1(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京，100015) 2(国家食品质量监督检验中心，北京，100015)

山药酒是以山药为主要原料，经糖化、发酵、浸泡等工艺酿制而成的饮料酒，因具有滋养强壮，助消化，敛虚汗，止泻之保健功效，日渐成为消费者喜爱的酒种[1]。萜类化合物是天然产物中的一类重要的次生代谢产物，由甲戊二羟酸衍生而成，结构复杂多变，分子式为异戊二烯单位倍数((C5H8)n)的烃类及其含氧衍生物，依据分子结构中异戊二烯单元的数目不同分为不同类型，如：(C5H8)1为半萜类，(C5H8)2为单萜类，(C5H8)3为倍半萜类等，它们多以游离态存在，部分以糖、酯或内酯形式存在于生物体中，具有抗肿瘤、消炎、降血脂等功效，萜类化合物也是山药中的生物活性成分，经发酵而成的山药酒，可最大程度的保留其功效[2]。目前，国内外对萜烯类化合物的研究主要集中于白酒[3-4]、葡萄酒[5-6]、苹果酒[7]中，采用固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等前处理技术与气相色谱质谱(GC-MS)或气相色谱串联质谱(GC-MS-MS)相结合，可实现对萜烯类化合物的分析定量。

山药酒作为我国特有的新兴酒种，其萜烯类化合物的测定技术尚属空白。本研究以不同工艺制备的山药酒种为分析对象，针对其基质复杂及风味物质干扰等难题，优化建立了山药酒中萜烯类化合物的分析技术，并采用这一技术探索不同山药酒中萜烯类化合物组成特征，为深入研究山药酒的保健功效，提升产品品质，提供技术手段和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药原酒(1)，山药露酒(2～7),山药黄酒(8～9)：河南焦作。

叶绿醇(纯度≥98%)：南京罗奇特生物科技有限公司;香茅醇(纯度≥95%)、ɑ-松油醇(纯度≥97%)、芳樟醇(纯度≥98%)：百灵威科技有限公司;长叶松烯(纯度≥83.1%)、(-)-龙脑(纯度≥98%)、橙花叔醇(纯度≥98.5%)、合金欢醇(纯度≥97%)、2,4-癸二烯醛(纯度≥90%)、角鲨烯(纯度≥98%)、p-伞花烃(纯度≥98%，内标)、甲醇(色谱纯)、正戊烷(色谱纯)、乙醚(分析纯，纯度≥98%)：上海安谱实验科技股份有限公司;NaCl、二氯甲烷、无水硫酸钠：分析纯，北京化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

岛津GC/MS-QP2010 Plus气相色谱-质谱联用仪(配备AOC5000自动进样器),日本岛津公司;Milli-Q Reference超纯水系统,美国Millipore公司;85 μm PA聚丙烯酸酯微萃取头,美国Supelco公司;INNOWAX色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 mm),美国HEWLETT PACKARD公司。

1.3 方法

1.3.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)条件[8]

称取4 g NaCl于事先放置玻璃转子的顶空瓶中，加入10 mL已稀释至10%(体积分数)的酒样，将固相微萃取萃取头插入已平衡15 min的顶空瓶，在40 ℃磁力搅拌水浴锅内保温萃取45 min，随后将萃取头取出，直接供GC/MS分析。

1.3.2 同时蒸馏萃取(SDE)条件[9]

量取50 mL酒样于SDE装置右侧圆底烧瓶中，加250 mL蒸馏水，左侧接入装有50 mL二氯甲烷的圆底烧瓶，保持两侧微沸萃取8 h，冷却并收集有机相过无水硫酸钠脱水，氮吹至1 mL供GC-MS分析。

1.3.3 液液萃取(LLE)条件[4]

量取50 mL酒样并将酒精度稀释至10%，加NaCl至饱和，再用50mL、50 mL、30 mL正戊烷∶乙醚[V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1]萃取3次，萃取液中加入50 mL超纯水，用Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液调节水相pH为10，有机相过无水硫酸钠后氮吹浓缩至5 mL。

依次用50 mL甲醇、50 mL乙醚和50 mL正戊烷预淋洗硅胶柱(20 cm×2 cm)。将浓缩后的有机相加入硅胶柱中，以流速1 mL/min依次用50 mL重蒸戊烷(F1)，50 mL重蒸的戊烷∶乙醚(体积比分别为80∶20，F2；50∶50，F3)， 50 mL甲醇(F4)洗脱得到4个组分(控制洗脱流速在1～1.5 mL/min)。收集各组分，氮吹浓缩至200 μL，待GC-MS分析。

1.3.4 GC-MS条件

色谱条件：所用色谱柱为HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 mm)，柱温采用程序升温，初温35 ℃，保持2 min后以2 ℃/min升至90 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min后以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。进样口温度250 ℃，不分流进样1 min，载气为氦气。

质谱条件：MS电离方式为EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质谱扫描范围35～350 amu，质谱分析所用数据库为NIST14库。

1.3.5 标准溶液的配制

称取萜烯类标准品10 mg(精确至0.01 mg)至10 mL容量瓶中，以正戊烷溶解并定容，配制成质量浓度为1. 0 mg/mL的萜烯类化合物标准储备液，再逐级稀释至一系列质量浓度梯度的混合标准溶液，每一质量浓度梯度的混合标准溶液中加入5 μL终质量浓度为0.533 mg/L的p-伞花烃为内标。

2 结果与分析

2.1 分析方法的选择和优化

萜类化合物在植物中一般以结合态和游离态存在，部分游离态化合物含量较低，加之山药酒酒精度较高，醇酯类挥发性化合物种类多，因此必须选择适当的样品前处理方法结合灵敏度较高的仪器分析技术，才能实现准确分析的目标[10]。本实验选择HS-SPME、SDE、LLE三种前处理方法进行优选，这也是酒中挥发性成分测定较多采用的3种经典方式，并结合GC-MS条件的优化，建立山药酒中痕量萜类化合物的的分析技术。

分别对3种方法提取的样品液进行GC-MS分析，根据可定性组分数量进行比较。图1为顶空固相微萃取(a)、同时蒸馏萃取(b)、液液萃取F1组分(c)及F3组分(d)的总离子流图，采用HS-SPME、SDE、LLE 3种方式分别鉴定出4种、7种和10种萜烯类化合物，采用LLE具有较好的效果。

图1 不同方法比较GC-MS总离子流图Fig.1 Comparison of GC-MS total ion chromatograms by different methods

其中，采用HS-SPME萃取方式，酒中大量酯类和醇类等含量较高的组分极易被吸附，导致痕量萜类组分被包在这些组分内，响应值低，较难定性；同时蒸馏萃取法是通过同时加热样品液与有机溶剂至沸腾来实现目标成分的富集、浓缩，由于制备过程中长时间加热，造成小分子萜烯的挥发和氧化，减少了这些成分的检出率；而LLE方式，萜类化合物在饱和食盐水中溶解度较低，易被有机试剂萃取，利用正相色谱技术将萃取液按极性大小洗脱，分段收集，从而减少损失，最大限度提取目标化合物，因此本实验采用这一方式对山药酒中萜类痕量成分进行提取。

参照FAN等[11]的实验方法，对提取溶剂种类、洗脱液配比进行选择和优化，并根据组分分离效果对程序升温条件进行优化，结果表明通过V(正戊烷)∶V(乙醚)=1∶1萃取后,经溶剂洗脱实现了山药酒中10种萜类化合物的准确定性定量，萜类化合物主要集中在F1(反式橙花叔醇、长叶松烯、芳樟醇、香茅醇)、F3组分(角鲨烯、(-)-龙脑、植醇、合金欢醇)中，F2(反式，反式-2,4-癸二烯醛)和F4组分(α-松油醇)各检测到1种萜类成分。

2.2 山药酒中萜烯类化合物定量方法评估

通过线性范围及相关系数、检出限和定量限以及相对标准偏差和回收率，对方法进行综合评估，结果见表1。

表1 10种萜类化合物的方法学评估结果Table1 Methodological evaluation results of 10 terpenoids

注：f表示作标准曲线所取的点数。

其中，各萜烯类化合物标准曲线线性范围在11.9～30 390.2 μg/L，相关系数R2均大于0.993 6，具有较好的线性；分别以信噪比为3和信噪比为10时的质量浓度作为检出限和定量限，其检出限为0.56～26.96 μg/L，定量限为1.86～89.88 μg/L；分别采用该方法对样品平行测定6次计算其相对标准偏差，在0.4%～1.7%之间；通过添加近等量的标准品，平行测定6次，加标回收率在92.68%～103.21%。上述结果显示该方法灵敏度高，结果准确可靠，可满足山药酒中痕量萜烯类化合物定量分析要求。

2.3 山药酒中萜烯类化合物组成及保健功效

分别对山药原酒(1)、山药露酒(2～7)、山药黄酒(8～9)中萜烯类化合物进行分析，其化合物类别和含量详见表2。

从萜烯类化合物组成看，3个类别山药酒中共鉴定出10种萜烯类化合物，包括5种单萜类化合物，分别为芳樟醇、香茅醇、反式2,4-癸二烯醛、(-)-龙脑和α-松油醇、3种倍半萜烯类化合物为橙花叔醇、长叶烯与合金欢醇，1种二萜类化合物叶绿醇，1种三萜类化合物角鲨烯，其中山药原酒和露酒均检出10种萜烯类化合物，而山药黄酒未检出合金欢醇。这3类山药酒其原料均产自河南焦作，尽管酿造工艺不同，但所含萜类化合物种类相近，表明其原料产地对山药酒中萜烯类组成具有一定的影响。

从萜烯类化合物含量来看，各山药酒均存在差异，萜烯类化合物总量最高的是山药原酒，为293.24 μg/L，其中萜烯烃含量为36.168 μg/L，萜烯氧化物含量为257.072 μg/L；山药露酒中萜烯类总量在42.266～183.253 μg/L，多为萜烯氧化物；山药黄酒萜烯类化合物总量相近，但组成差异较大，其中8#样品以萜烯烃类化合物为主，含量为112.75 μg/L，样品9中则主要是萜烯类氧化物，达到总量的90.97%。结果表明，不同加工工艺对山药酒中萜类化合物的含量产生一定影响。

表2 山药酒中萜烯类化合物测定结果Table 2 Determination results of terpenes in yam wine

注：n.d.表示没有检测到；

从单个萜烯的含量来看，长叶松烯(平均含量7.968 μg/L)、角鲨烯(平均含量15.513 μg/L)、龙脑(平均含量33.341 μg/L)和香茅醇(平均含量36.408 μg/L)在不同工艺的山药酒中含量均较高，特别是龙脑，在山药原酒中其质量浓度达到100.164 μg/L，占萜烯类总量的34.16%。除上述物质，植醇和合金欢醇在山药原酒中含量较高，质量浓度分别为77.81 μg/L和29.74 μg/L；山药露酒含有较为丰富的是叶绿醇(平均含量49.175 μg/L)，山药黄酒中α-松油醇在萜类总量中也占有较大比例，达到8.3%。

山药酒中这些萜烯类化合物不仅具有独特的香味，还具有一定的保健功能，如龙脑具有类似樟脑和松木的气息[12]。据药典(2015)记载，龙脑常用量为0.3～0.9 g，主治开窍醒脑、清热解毒等；吴娟等[13]通过大鼠尾静脉注射15 μg/g即可促进血脑屏障通透性；长叶松烯，给人以精神振奋之感，并有抗菌、消毒的功效[14]；姜文广等[15]阐述了芳樟醇是合成维生素E的重要中间体，具有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等药理活性，其中BATISTA[16]采用口服方式给予小鼠芳樟醇(5～100 μg/g)可达到镇痛作用；国外相关文献发现橙花叔醇、角鲨烯具有抗肿瘤和免疫调节等活性[17-20]。目前，萜类化合物多种功效的作用机制有待进一步明确，对这些功效成分的剖析，将有助于山药酒这一新兴酒种的深度开发与研究。

3 结论

本实验针对山药酒特点，通过实验条件的选择、优化，建立了液液萃取结合气相色谱质谱联用技术对山药酒中萜烯类化合物的分析方法，实现对10种萜类化合物的准确定量，包含5种单萜类化合物，3种倍半萜烯类化合物，以及二萜类化合物及三萜类化合物各1种，对此方法进行评估，其相关系数R2≥0.993 6，检出限为0.56～26.96 μg/L，定量限为1.86～89.88 μg/L，相对标准偏差小于1.7%，加标回收率为92.68%～103.21%，表明该方法灵敏度高，结果准确可靠，可满足山药酒中痕量萜烯类化合物定量分析要求。采用这一技术对市售山药原酒、山药露酒和山药黄酒进行分析，其萜烯类化合物组成相近，但含量存在差异，表明原料产地与加工工艺对萜类化合物的构成具有一定的影响；从组成结构看，长叶松烯、角鲨烯、龙脑和香茅醇在不同山药酒中含量均较高，这些萜烯类赋予了山药酒独特的风味及保健功效，对其进行深入研究，将有助于山药酒的品质提升与深度开发。