乳铁蛋白对大鼠上颌扩弓及复发过程中腭中缝骨改建的影响

程 烨 张 程 葛孟柯 李天成 陈建伟 李 煌

上颌骨横向发育不足常常导致上颌牙弓狭窄、牙列拥挤、反牙合等正畸临床中常见的错牙合畸形。上颌扩弓是正畸治疗中广泛用于改善生长发育期儿童上颌骨横向发育不足的手段[1]。虽然上颌扩弓可以显著扩宽生长发育期儿童患者的上颌骨，去除扩弓装置后的复发却屡见不鲜[2]。如何提高上颌扩弓之后的稳定性、减少复发量一直是正畸医生关注的临床问题。

在上颌扩弓的过程中，腭中缝在应力牵张的作用下发生一系列的改建[3]，包括骨的改建和纤维组织的重新排列[4，5]。在上颌扩弓的应力刺激下，腭中缝区域的成骨量和破骨量同时增加，一般情况下成骨量的增加多于破骨[6]。去除扩弓装置后，成骨和破骨活动未能处于动态的稳定状态，成骨量不足或破骨量过多，是导致上颌扩弓后复发的主要原因[7]。临床上常用的减少复发的方式是延长扩弓保持的时间，但这样的方法不仅延长了矫治时间，降低患者的舒适度，更因为患者的配合问题常常不能得到理想的保持效果。故学者们试图寻找一种更为积极的方式，通过增强上颌扩弓过程中的成骨活动和（或）抑制破骨活动来保持扩弓效果[8]。

乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种铁结合球状糖蛋白，生理性存在于人体多种体液中，具有抗菌、免疫调节等多项生理功能。除此之外，LF在骨代谢中的作用也逐渐受到关注[9]。在近年来的研究中，LF被发现不仅可以增强成骨前体细胞的成骨分化、促进成骨细胞的增殖、防止其凋亡[10]，还对抑制破骨细胞生成、降低破骨活性起一定的作用。所以理论上LF 干预可能可以通过在上颌扩弓过程中调节腭中缝区域的骨改建来提高上颌扩弓的稳定性、减少复发。

与此同时，Hou 等[11]的研究发现LF 对大鼠骨质的改善作用与LF 的浓度有一定的正相关，即浓度更大的LF 有更好的改善骨质疏松的能力。Walli等[12]将LF 加入小鼠的骨髓细胞体外培养模型中，观察显示LF 只有在较高浓度下才可以抑制破骨细胞分化。故LF 对骨代谢的调节作用可能具有一定的计量依赖性[13]。

基于以上的发现和假设，本研究在Wistar 大鼠上颌扩弓及复发过程中采用不同浓度的LF 灌胃干预，以观察这些浓度的LF 灌胃对大鼠上颌牙弓扩宽量、复发量以及其过程中腭中缝骨质的影响。

资料和方法

1.动物处理及分组

24 只5 周龄雄性Wistar 大鼠（成都达硕实验动物有限公司，中国），体重100±10g，SPF 级，用相同的基础饮食、饮水饲养。大鼠适应性饲养1 天后（D0），随机分为3 组：单纯扩弓组（EO），安装扩弓装置；扩弓+LF1 组（E+LF1），扩弓同时给予10mg/kg/d LF 溶液灌胃；扩弓+LF2 组（E+LF2），扩弓同时给予1g/kg/d LF 溶液灌胃；每组8 只大鼠。本研究动物实验经四川大学华西口腔医院动物伦理委员会审查批准。

用0.014 英寸澳丝弯制成有两个平行臂的两眼开大簧作为扩弓装置（图1A）。装置两臂对称性打开（图1B），测力计测得压缩两臂至平行时将产生100±5g 的对抗力，即初始扩弓力值。大鼠经腹腔注射10%水合氯醛溶液（3ml/kg体重）麻醉后，将扩弓装置两臂平行地安置在大鼠上颌两侧磨牙牙合面，使用Fuji ORTHO LC 光固化正畸粘接系统固定（图1C）。

图1 扩弓装置及其在大鼠口内安装

7天的扩弓后（D7），每组随机挑选4 只大鼠处死并获取腭部标本，其余大鼠去除口内装置即进入复发阶段。复发7 天后（D14），处死剩余的每组4 只大鼠并获取腭部标本。

2.LF灌胃干预

用LF 粉（95%，Westland Milk products 公司，新西兰）分别配置1mg/ml、100mg/ml 的LF 生理盐水溶液。从D0 起，以1ml/100g 体重的标准每日定时分别给两组大鼠灌胃：E+LF1 组使用1mg/ml LF 溶液，E+LF2 组使用100mg/ml LF 溶液；EO 组用等量的生理盐水灌胃。

3.牙弓宽度测量

在D0 安置装置前、D7 处死大鼠前或除去装置后、D14 处死大鼠前分别使用游标卡尺在大鼠口内测量大鼠上颌两侧第一磨牙腭侧龈缘间的距离。

4.标本获取及处理

大鼠采用过量麻醉配合断颈的方式处死，剪下其上颌骨并置于4%多聚甲醛溶液中，于4℃固定48 小时后的标本洗净即用于Micro-CT 扫描、分析。用于HE 染色的标本固定、洗净后置于10%EDTA脱钙液中脱钙。之后，标本脱水、浸蜡，进行常规石蜡包埋。在大鼠第一磨牙范围内，垂直于腭中缝长轴对组织块进行切片，得到3μm 厚的连续切片。

5.Micro-CT检测

标本置于Micro-CT 扫描管中，在Micro-CT 扫描仪（Scanco Medical 公司，瑞士）载物台上进行扫描，扫描相关参数为：电压90kV，电流50μA，投影数450，分辨率10μm。

用VG Studio Max 软件（Volume Graphics 公司，德国）对扫描的上颌骨及上颌牙列进行三维重建和分析。研究分析的感兴趣区域位于大鼠上颌第一磨牙近远中根尖孔间的腭中缝区域，其横向延伸至腭中缝骨边界两侧各200μm 的范围（图2AB）。利用软件的“壁厚分析”功能描绘感兴趣区域内的腭中缝两侧骨壁，并测量两骨壁之间的距离作为腭中缝宽度（图2CD）。感兴趣区域的其他测量参数还包括：骨体积分数（BV/TV），骨小梁数目（TbN），骨小梁厚度（TbTh），骨小梁间隙（TbSp），校正平均灰度（MGS）。为消除误差，用测量出的MGS 除以每个标本的灰度阈值，即得到校正后的MGS，本文后续描述中将直接用MGS 表示。

6.HE染色

石蜡切片脱蜡、水洗，依次经历苏木素染液染色、盐酸酒精分色、氨水返蓝以及伊红染液染色后置于普通光学显微镜下观察。

7.统计学分析

图2 Micro-CT 分析

实验所得量化结果均以平均数±标准差的形式表示，使用SPSS 软件对两个时间点（D7、D14）之间的数据进行t检验比较；对三个实验分组或三个时间点（D0、D7、D14）之间的数据进行单因素方差分析以及Tukey’s 检验。P＜0.05 则被认为有统计学差异。

结 果

1.牙弓宽度变化情况

牙弓宽度的测量结果显示，D0 和D7 时3 组大鼠的牙弓宽度都没有统计学差异。经过7 天的复发期后，D14 时EO、E+LF1 两组大鼠的牙弓宽度与扩弓结束时相比有明显的下降；而E+LF2 组D14 的牙弓宽度明显大于其余两组，且与其在D7 的牙弓宽度相比没有显著下降（图3）。

图3 牙弓宽度变化情况

2.Micro-CT测量分析结果

（1）腭中缝宽度：扩弓结束时，三个组的腭中缝宽度测量值数据没有统计学差异。D14 时EO、E+LF1 组的腭中缝宽度基本一致，而E+LF2 组腭中缝显著窄于EO 组（图4A）。

（2）BV/TV：在D7、D14 两个时间点，E+LF1 组的BV/TV 稍大于EO 组，但两者之间没有明显差异。E+LF2 组的BV/TV在两个时间点都显著大于EO 组（图4B）。

（3）骨小梁参数：E+LF2 组的TbN在D7 和D14都显著大于EO 组。在两个时间点，EO、E+LF1 两组之间的TbN 没有统计学差异（图4C）。三个实验组在整个实验期间TbTh 测量值都没有明显差异（图4D）。于两个观测时间点，EO、E+LF1 两组的TbSp 都没有统计学差异，而TbSp在E+LF2 组则显著低于EO 组（图4E）。

（4）校正MGS D7、D14 时，E+LF1 组腭中缝骨质的MGS 稍大于EO 组，但两者间没有统计学差异；E+LF2 组的MGS 测量值在两个时间点都明显大于EO 组（图4F）。

图4 Micro-CT 测量分析结果

3.HE染色

与EO 组相似，LF 灌胃干预的两组大鼠腭中缝在D7 也可见明显向两侧扩展的软骨层，其间的纤维组织受到牵拉，中缝区域有明显的骨膜细胞、成骨样细胞的迁移和聚集，腭骨骨端的边缘可见新骨的沉积；7 天的复发期后，LF 灌胃干预组大鼠腭中缝也经过进一步改建，随骨端边缘新骨的继续形成和骨膜下细胞的进一步聚集，原先的软骨结构基本消失（图5）。

与EO组不同的是：LF 灌胃干预的两组大鼠D7 时腭中缝可见更多的新骨形成；在D14 这两组大鼠的腭中缝也可见更多的粉红色新骨沉积，以及更多的骨膜细胞、成骨样细胞聚集（图5）。

图5 HE 染色

三组大鼠的HE 染色中均未见明显的炎症反应。

讨 论

近年来LF在骨代谢中的作用逐渐受到关注[9]。成骨作用方面，LF 被发现不仅可以增强成骨前体细胞的成骨分化、促进成骨细胞的增殖，还可以防止成骨细胞的凋亡[14～16]。将成骨细胞种植在富含LF 的涂层材料上，可以检测到成骨细胞的黏附、增殖和分化都有显著的增强[10]。破骨作用方面，LF 被证明对抑制破骨细胞生成、降低细胞破骨活性等方面起一定的作用[16]。LF 添加入小鼠骨髓细胞培养基可以明显减少新分化的破骨细胞数量[9]。

与此同时，LF 对成骨、破骨方面的作用与其作用浓度密切相关。以往的研究表明，在体内，LF 对去势大鼠的骨质改善作用呈明显的剂量依赖性[13]；在体外，只有高浓度的LF 才能抑制破骨前体细胞的破骨向分化[12]。Yoshimaki 等[17]制造大鼠的颅骨缺损模型，分别给大鼠10mg/kg 体重、100mg/kg 体重的LF 腹腔注射。结果发现100mg/kg 体重LF 注射组在颅骨缺损处可以观察到更多的成骨样细胞聚集，有更多的骨修复。另一项给予去势大鼠不同浓度的LF灌胃的研究，LF 浓度梯度从10mg/kg 体重到2g/kg体重不等。结果表明LF 对大鼠骨质的改善作用呈一定的计量依赖性，且只有LF 浓度达到1g/kg 体重及以上时才对破骨活动有抑制作用[11]。因此，为研究不同浓度LF 灌胃对大鼠上颌扩弓及复发过程中腭中缝骨改建的影响，我们设定的LF 灌胃浓度为10mg/kg 体重和1g/kg 体重。

HE 染色结果提示，在大鼠腭中缝正常骨改建的基础上，LF 灌胃干预的两组大鼠中缝两端的骨板边缘有更多的新骨形成；在机械应力之后的骨改建阶段LF 灌胃干预的两组大鼠腭中缝有更多的骨膜细胞、成骨样细胞聚集。可能是LF 作用导致的这些有成骨潜力的细胞向腭中缝区域迁移，或者LF 促进了这些细胞的增殖。这可能是LF 灌胃组大鼠腭中缝更多新骨形成的原因。

Micro-CT 测量分析结果显示，E+LF2 组的腭中缝宽度在D14 显著小于EO 组，这可能是因为在机械牵张力结束后，大鼠腭中缝发生进一步的组织改建，而E+LF2 组大鼠在中缝两侧的骨端表面有更多的骨质沉积。BV/TV 测量、MGS 测量都显示E+LF2在D7、D14 两个时间点的测量值都显著大于EO组。这表明了1g/kg 体重的LF 灌胃导致了大鼠腭中缝骨质的致密程度在两个时间点都被明显的增强了。而相比于EO 组，E+LF2 组的骨小梁参数TbN 测量值显著增加、TbSp 的测量值显著下降则提示在高浓度LF 灌胃的作用下大鼠腭中缝的骨小梁变得多而排列紧密。

有趣的是，组织学检测发现的E+LF1 组大鼠腭中缝更多的新骨形成并没有体现在Micro-CT 的检测结果中。以往的研究中也曾出现二者检测结果不一致的情况：Yoshimaki 等[17]探究LF 对骨质的修复作用时，低浓度的LF 干预组组织学染色观察到成骨细胞的增多、成骨效应的增强，而Micro-CT 检测结果却显示与对照组没有显著差异，即没有体现出组织学的改变。由此可以推测，E+LF1 组可能由于LF 的灌胃浓度较低，所产生的增强成骨活动的效应较弱，所以导致组织学的改变不足以带来Micro-CT可以检测到的宏观的改变。除此之外，牙弓宽度的变化则是衡量LF 对上颌扩弓及复发的影响更为宏观且最具临床意义的测量指标。本实验大鼠牙弓宽度的测量显示：三个实验组大鼠的牙弓宽度基线是一致的，扩弓7 天后4 组大鼠的上颌扩弓量也没有显著差异；经过7 天的复发期后，EO、E+LF1 两组大鼠的牙弓宽度出现了明显的复发，而E+LF2 组则较好的保持了上颌扩弓后的牙弓宽度。这样的结果表明1g/kg 体重的LF 灌胃不能增加上颌扩弓的扩弓量，但可以较好的保持扩弓的效果，维持上颌扩弓的稳定性。

综上所述，LF 灌胃可以在大鼠上颌扩弓及复发的过程中促进腭中缝的新骨形成，并呈一定的计量依赖性；高浓度LF 灌胃可以在大鼠上颌扩弓及复发的过程中增强腭中缝的骨质，减少上颌扩弓的复发量，维持上颌扩弓的稳定性。