L-苹果酸提取黑豆皮中花色苷的正交优化

丁洁，陈静，沙芮，牛犇，梁宁

(甘肃省商业科技研究所，甘肃 兰州 730020)

黑豆是豆科植物大豆的黑色种子，作为食药两用的作物，具有悠久的历史[1].古代医书中记载的黑豆具有乌发、补肾、解毒、延年益寿等功效[2].现代中医学也表明黑豆可乌发、活血解毒、明目、软化血管、治疗不孕等[3].花色苷在黑豆皮中含量较高[4]，所以黑豆具有自身抵御过氧化的保护系统、抗衰老、抗逆生理等生理作用，对人体健康有着极大的改善.黑豆种皮因富含色素而呈现黑色并具有抗氧化、抗炎、免疫调节、降血脂及抗氧化等多种生理活性[5-7].因此黑豆对人体及动物抗衰老、抗氧化、降低肥胖风险与消除肿瘤等方面有着重要意义[8-12].

目前黑豆花色苷提取溶剂多见无机酸，如盐酸，或酸性醇溶液[13-14].L-苹果酸(L-malic acid)是生物体糖代谢过程中产生的重要有机酸，广泛存在于自然界的水果和蔬菜中，1967年被美国食品和药品管理局登记确认为一种安全、无毒、无害、可食用的有机酸[15].L-苹果酸可以缓解体力疲劳，能够增加机体的耐力；具有抗氧化活性，能够捕获自由基[16].在食品工业中，L-苹果酸用做加工和配置饮料、露酒、果汁，是一种良好的食品添加剂和高级饮品调味剂.L-苹果酸为天然果汁的重要成份，与柠檬酸相比具有酸度大(酸味比柠檬酸强20%)，但味道柔和(具有较高的缓冲指数)，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”.鉴于目前尚未见到L-苹果酸提取黑豆花色苷的相关报道，本试验以黑豆皮为原料，研究L-苹果酸浓度、料液比、温度、提取时间4个因素对黑豆皮花色苷含量的影响，通过单一pH法计算[17]，运用正交试验法优化L-苹果酸提取黑豆皮花色苷的工艺，旨在为开发花色苷功能性食品药品提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料

黑豆皮，购自兰州市场的黑豆浸泡后剥皮晾干，备用；纯水自制；L-苹果酸(德国三颗星食品物料公司)，批号20180819S；XS225A型电子分析天平普利塞斯，瑞士；优普UPT-I-20L落地式纯水机四川优普超纯科技；UV2300Ⅱ型双光束紫外可见光光度计(上海天美科学仪器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮花色苷的提取工艺 准确称取干燥粉碎后的黑豆皮2 g，加入一定体积的L-苹果酸溶液，在一定温度下加热，振荡，抽滤、定容.

1.2.2 花色苷含量的测定将提取液稀释适宜倍数，通过紫外分光光度计测定吸光度，参照Fuleki[18]的计算方法计算.

花色苷含量=(A×MW×DF×1 000)/ (ε×1)

其中，A为吸光值；MW为分子量(以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为标准，449.4)DF为稀释倍数；ε为消光系数，26 900 L/(cm·mg).

1.2.3 单因素试验 参考翟硕等的方法[4]固定L-苹果酸溶液浓度(质量分数)30%，黑豆皮与L-苹果酸溶液料液比1∶20 (g∶mL)、温度30 ℃、提取60 min的情况下，改变另外的因素水平，L-苹果酸溶液浓度(g/mL)为5%、10%、20%、30%、40%；料液比(g∶mL)为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40；温度为20、30、40、50、60 ℃；提取时间为30、60、90、120、150 min；进行单因素试验，以提取率为指标，择优参数.

1.2.4 正交试验设计 采用SPSS 19.0软件，在单因素试验基础上，依据单因素试验结果设置水平，以L-苹果酸溶液浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素的3个水平设计正交试验L9(34)优化L-苹果酸提取黑豆皮花色苷工艺.

2 结果与分析

2.2 单因素试验结果及分析

2.2.1 L-苹果酸溶液浓度对黑豆花色苷提取率的影响 由图1结果可知，其他条件不变时，黑豆皮花色苷的提取率随L-苹果酸溶液浓度的增加而增加.当L-苹果酸溶液浓度达30%时，提取率最大，与酸浓度5～20 %相比，差异显著，当L-苹果酸溶液浓度过高花色苷提取率有所降低，由于酸性较强引起花色苷糖水解，导致含量下降.考虑其稳定性，防止花色苷水解.因此选择L-苹果酸溶液浓度10%～30%为正交试验因素水平.

2.2.2 料液比对黑豆皮花色苷提取率的影响 由图4可知，黑豆花色苷提取率随着料液比的提高呈增加趋势.当料液比<1∶10时，由于溶剂量较少，花色苷溶解不完全，提取率较低，当料液比>1∶10时，黑豆花色苷提取率大幅提高，是由于花色苷向提取液扩散速率变快，充分溶解，溶解量增大.而当料液比继续增加，花色苷提取率变化不大，料液比超过1∶30提取率基本不变，说明花色苷溶解速率达到平衡.当料液比继续增大，提取率基本不变，从节约成本角度考虑，料液比选择1∶10～1∶30为正交试验因素水平.

图1 L-苹果酸浓度对黑豆皮花色苷提取率的影响Figure 1 Effect of L-malic acid concentration on extraction rate of anthocyanins from black soybean peel

图2 料液比对花色苷提取率影响Figure 2 Effect of material to liquid on extraction rate of anthocyanins

2.2.3 提取温度对黑豆皮花色苷提取率的影响 由图3可知，黑豆皮花色苷提取率随着提取温度的增长呈上升趋势.20 ℃到30 ℃提取率上升较缓慢，温度由30 ℃升至40 ℃时，粗提液中黑豆皮花色苷提取率上升较快最高，40 ℃以后花色苷提取率基本不变，随着温度进一步升高，超过50 ℃花色苷提取率略有下降.产生这种现象的原因可能是随着温度升高，花色苷溶出速度加快.由于花色苷是热敏性色素，温度进一步升高，会破坏已溶出的花色苷结构[15]，部分花色苷发生分解，综合降低能耗因素考虑，选择30～50 ℃为正交试验因素水平.

图3 温度对花色苷吸光度的影响Figure 3 Effect of temperature on extraction rate of anthocyanins

2.2.4 提取时间对黑豆皮花色苷提取率的影响 由图6可知，随着提取时间的延长，黑豆皮花色苷提取率呈上升趋势，在30～90 min内花色苷提取率增加较快，提取时间超过90 min花色苷提取率不再上升，说明90 min左右花色苷提取完全.继续增加提取时间，花色苷可能被分解.因此，选择60～120 min为正交试验因素水平.

图4 提取时间对花色苷提取率的影响Figure 4 Effect of extraction time on extraction rate of anthocyanins

2.3 正交试验结果及分析

根据单因素试验结果，选择4个影响因素的3个水平设计正交试验L9(34)优化L-苹果酸提取黑豆皮花色苷工艺，考察指标为花色苷提取率，正交试验因素表，见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3.

由表3可知，L-苹果酸提取黑豆皮花色苷的影响因素中L-苹果酸浓度影响显著，料液比的影响极显著，温度和提取时间次之，影响不显著.极差分析结果中得出的最佳工艺是A3B3C1D1；即L-苹果酸浓度为30%，料液比为1∶30，加热温度为30 ℃，提取时间为60 min.

2.4 验证试验

由于极差分析最优工艺与正交试验结果最优工艺不一致，正交试验最优工艺为A3B3C2D1，而极差分析得出的最佳工艺是A3B3C1D1，所以需进行验证试验.以上述2组最佳工艺条件进行验证试验.结果表明，极差分析最优工艺下花色苷含量为3.538 mg/g，RSD=1.28%(n=6)，正交试验最优工艺下花色苷平均含量为3.571 mg/g，RSD=0.78%(n=6).2种方法提取花色苷含量差距不大，从节约能耗，降低成本的角度考虑，选择极差分析最优工艺A3B3C1D1，即L-苹果酸浓度为30%，料液比为1∶30，提取温度为30 ℃，提取时间为60 min.

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析

F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00.

3 讨论

鉴于目前尚未见到L-苹果酸提取黑豆花色苷的相关报道，本研究通过正交试验法优化了L-苹果酸提取黑豆皮花色苷的工艺，研究了L-苹果酸浓度、料液比、提取温度和提取时间对黑豆皮花色苷得率的影响.结果表明，在最优工艺提取下，黑豆皮花色苷含量为3.538 mg/g.一般来说工业化生产在10 g/mL左右，但该工艺条件下料液比较大，是由于干燥粉碎后的黑豆皮在吸水溶胀后没有多余提取液，使花色苷溶解不完全，对花色苷含量有影响.因近年来合成色素的使用受到限制，黑豆作为一种新型天然的色素源也得到重视[19].同类花色苷提取溶剂多用无机酸或酸性醇溶液[21]，在后续处理中成本较高.L-苹果酸作为一种安全、无毒、无害、可食用的功能性有机酸，可以通过减少老年机体组织内自由基的产生或加速清除，起到防止自由基损伤机体组织的作用[20].L-苹果酸虽价格上高于无机酸，但其本身是既是食品添加剂又是药物工业原料，选择作为溶剂提取的黑豆花色苷可直接作为安全可靠的食品原料和功能药品中间体添加.试验发现，L-苹果酸提取黑豆皮花色苷可在室温下进行，溶剂充分的情况下，黑豆皮花色苷在L-苹果酸溶液中溶解速度较快，提取时间短，提取率较高，节约能耗.L-苹果酸本身具有抗氧化性，采用该溶剂提取的花色苷是否抗氧化性增强，还有待于进一步研究.

4 结论

通过单因素和正交试验分析，采用L-苹果酸溶液提取黑豆皮花色苷的各个影响因素主次顺序为料液比>L-苹果酸浓度>提取时间>提取温度，最优工艺条件为：L-苹果酸浓度30%、料液比1∶30，提取温度30 ℃，提取时间为60 min.黑豆皮花色苷含量为3.538 mg/g.可为天然色素来源的花色苷的研究和开发提供参考依据.