肾痿复方对糖尿病肾病大鼠肾组织MMP-9/TIMP-1表达的影响

钟 霞，张宇韦，谭睿陟，樊均明，王 丽

（1西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 646000;2成都医学院）

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症，目前已成为终末期肾病(ESRD)最常见的病因。其发展特点是肾小球基底膜增厚，胞外基质蛋白在肾间质和肾间质区扩增，最后发展为肾小球硬化、肾间质萎缩和纤维化并伴有肾功能障碍。多种生长因子、信号通路以及高血糖都会影响DN 中ECM 的合成和转化率[1]。肾痿复方是本课题组从“肾痿学说”角度出发，以黄芪、三七为君药制成，具有益气补肾、活血化瘀的功效。此方已在临床实践中应用多年，对各种原因引起的慢性肾脏疾病有显著疗效。前期临床研究表明在西医治疗基础上，根据中医辨证论治加入肾痿复方治疗能有效改善糖尿病肾病患者的肾功能，提高患者的生存质量[2]。本研究拟通过应用肾痿复方干预后，观察实验组大鼠肾组织中纤维化和金属蛋白酶指标的改变情况，初步探讨肾痿复方防治糖尿病肾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40 只SPF 级SD 大鼠，SPF 级，雄性，体重（180±20）g，由西南医科大学SPF动物实验中心提供（许可证：SYXK(川)2013-065）。

1.2 主要药品、试剂、仪器

肾痿复方组成（黄芪50 g，三七10 g，当归10 g，怀牛膝30 g，昆布30 g，牡蛎10 g，大黄6 g，丹参15 g，川穹15 g）购自西南医科大学附属中医医院；链脲佐菌素（STZ）购自美国sigma公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒购于碧云天试剂有限公司（批号：C0105）；AB-PAS 染色试剂盒购于Solarbio 公司（批号：G1285）；ɑ-SMA 抗体购自ebioscience 公司（货号：14-9760-82）；TGF-β1 抗体购自Cell Signaling Tech⁃nology 公司（货号：3711S）；TIMP-1 购自Proteintech公司（货号：10753-1-ap）；MMP-9抗体购自美国Bio⁃world Technology 公司（货号：BS1241）；正置荧光显微镜购自日本尼康公司；全波长酶标仪购自美国BioTek Synergy2；凝胶成像系统购自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

40 只雄性SD 大鼠，适应性喂养1 周后，随机为正常对照组、糖尿病肾病组、肾痿复方低、高剂量组、每组10只，自由饮水和进食。正常组大鼠给予标准普通饲料喂养，模型组和实验组大鼠高脂高糖饲料喂养8周后，禁食12 h，腹腔注射链脲佐菌素（strepto⁃zoticin，STZ）35 mg/kg(用pH=4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)建立糖尿病模型，正常对照组腹腔注射等容量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。5 d 后大鼠尾静脉取血，将血糖≥16.7 mmol/L 视为糖尿病造模成功的标准。模型成功后第2 d开始灌胃，肾痿复方根据“动物与人体的公斤体重剂量则算系数表”换算，既低剂量=正常人每日给药剂量÷人的重量×6.25，高剂量是低剂量的4倍，连续灌胃7 d。

1.3.2 标本采集

处死大鼠前1 d用代谢笼收集排泄24 h 的尿液，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉（300 mg/kg）将大鼠麻醉，腹主动脉取血，将样本置于4 ℃的离心机中3 000 r/min离心10 min分离血清，检测Crea、BUN 含量。部分肾组织用10%中性甲醛固定，常规脱水、透明及浸蜡包埋后HE和PAS染色法观察肾脏形态学变化；部分肾组织冻存于-80 ℃冰箱，Western Blot 法检测相应蛋白表达水平。

1.3.3 肾组织中α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 表达含量测定

称取0.05 g 肾组织，组织匀浆后测定总蛋白含量，取50 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，经PVDF 膜转移后，用5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1一抗（稀释比例1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3×5 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗（稀释比例1∶3 000）常温孵育1 h，TBST 洗涤3×5min后，采用图像分析系统检测，结果以目标蛋白/内参灰度值表示。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，两组组间比较采用t检验，方差不齐或不服从正态分布，先将数据转换，若方差仍不齐，则用非参数检验；比较的对象大于两组时，采用单因素方差分析（One-WayANOVA），P＜0.05 差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 一般情况观察

正常对照组大鼠状态良好，饲养期间无死亡现象。糖尿病肾病组大鼠均出现糖尿病典型多饮、多食、多尿、体重下降的表现；与正常对照组相比，糖尿病肾病大鼠出现皮毛无光泽，精神萎靡，反应迟钝，一般活动明显变差等表现，以模型组表现最为明显。

2.2 肾痿复方对糖尿病大鼠生化指标的影响

24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮结果显示：与模型组比较，肾痿复方低剂量、高剂量治疗组大鼠24h 小时尿蛋白定量显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，肾痿复方高剂量治疗组血清肌酐、尿素氮水平均有所降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。

图1 24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮结果

2.2 病理组织学结果

2.2.1 肾脏HE染色结果

正常对照组大鼠肾小球形态结构清楚，肾小球和基底膜基本正常，系膜区无增生，肾间质无纤维化及炎性细胞浸润；模型组大鼠可见肾小球体积增大，基底膜增宽，系膜区明显增生，出现弥漫性结节样僵硬，结节周围环形致密物沉积，肾小管上皮细胞脱落，出现空泡样变性，管腔明显扩张；肾痿复方低剂量组、高剂量组大鼠较模型组稍轻，见图2。

2.2.2 PAS染色结果

正常对照组大鼠肾小球和肾小管结构基本正常，肾小球内红染物质均匀分布，细胞外基质无堆积，系膜细胞无增生；模型组大鼠肾小球内阳性物质及系膜基质明显增多，细胞外基质堆积，系膜细胞明显增生，基底膜节段性增厚；肾痿复方低剂量组、高剂量组较模型组病变有不同程度减轻，见图3。

图2 肾脏苏木精伊红(HE)染色（×400）

图3 肾脏PAS染色（×400）

2.3 Western Bolt结果

蛋白免疫印迹法显示：正常组大鼠肾组织α-SMA、TGF-β、TIMP-1 蛋白水平呈低表达，MMP9呈高表达；而糖尿病肾病模型组大鼠α-SMA、TGF-β、TIMP-1蛋白水平显著增高，MMP9蛋白表达降低；经肾痿复方干预后，低剂量组和高剂量组蛋白水平有不同程度改善，其中高剂量组尤甚，差异有统计学意义（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。见图4。

图4 各组大鼠α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表达差异比较

3 讨论

糖尿病肾病已成世界范围内的一个主要健康问题，基础科学和临床治疗都进行了大量的研究，虽然建立了治疗策略,如适当的血糖控制,血压控制和抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统等干预措施。尽管实施了这些策略，最终发展为终末期肾病的糖尿病患者数量仍然很高。因此，肾功能减退是糖尿病肾病研究的重点领域之一。糖尿病肾病的特征在于细胞外基质蛋白的过度沉积和肾小球滤过屏障的破坏。基质金属蛋白酶（MMPs）影响细胞外基质蛋白的分解和转换，表明MMP的表达改变可能导致糖尿病肾病[3]。临床研究表明肾纤维化与长期的损伤和失调的正常伤口愈合过程与过量的细胞外基质沉积有关[4]。基质金属蛋白酶是中性蛋白酶家族的成员，它们在肾小球ECM 降解和周转的过程中起主要生理决定因素。而金属蛋白酶组织抑制剂-1 作为MMP-9的抑制剂，可与其产生特异性结合影响糖尿病肾病中ECM的合成和转化率，在肾脏疾病的病理生理学中起着重要作用[5]。无论损伤类型和病因，肾纤维化通常是进行性肾病的最终结局，并导致正常肾脏结构的严重破坏和伴随的功能恶化[6]。TGF-β（转化生长因子-β）被充分鉴定为肾纤维化的中枢介质，与糖尿病肾病中纤维化的发展广泛相关。肾小管间质纤维化的潜在病理学的核心是上皮-间质转化（EMT），或管状上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化。该过程伴随着许多关键的形态学和表型变化，最终导致细胞从管状基底膜分离并迁移到间质中。最终，这些细胞作为活化的肌成纤维细胞存在，并进一步加剧纤维化状态。大量证据支持TGF-β和下游Smad 信号传导在肾纤维化的发展和进展中的作用，使其逐渐成为慢性肾脏病临床进展的重要生物学标志和治疗靶点[7]。

糖尿病中慢性肾病的最佳预防和治疗需要实施特异性干扰糖尿病肾病发病机理的疗法。糖尿病肾病的核心发病机制是虚、瘀、损；治疗原则既是标本又是虚拟治疗，治疗方法是补体不足、活血、温阳补肾；处方有黄芪健中汤、党骨补血汤等[8]。研究表明黄芪可通过下调血清肌酐、血尿素氮及糖化血红蛋白的含量发挥降低血脂、血纤维蛋白原、血液粘度，改善糖脂代谢，减少尿蛋白，延缓2型糖尿病肾病的症状[9-11]。三七及其活性成分可通过调节氧化应激、减轻炎症、抗纤维化等途径在糖尿病肾病中发挥防治作用[12-13]。临床研究显示当归补血汤可改善患者肾功能，调节患者细胞因子和纤维化相关指标如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)等的表达，具有抑制细胞因子聚集及延缓肾脏纤维化的作用[14]。当归中药复方可改善糖尿病引起的胰岛素抵抗和周围神经病变[15]。怀牛膝具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋的作用[16]。小鼠体内实验显示牡蛎的有效成分牡蛎多糖能够显著促进巨噬细胞增殖和吞噬，能够一定程度提高小鼠脏器系数和淋巴细胞增殖能力,提高变态反应强度，从而发挥免疫增强作用[17]。动物实验表明大黄的主要成分大黄素及大黄酸具有改善肾功能、抑制肾张纤维化的作用[18-19]。丹参具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效，可降低糖尿病大鼠一氧化氮、内皮素的含量，对肾组织有显著保护作用[20]。临床研究证明川穹可降低白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的水平[21]。

4 结论

在大鼠DN 模型中，肾痿复方可能通过调节MMP-9/TIMP-1 信号转导途径比值的失衡，降低α-SMA、TGF-β1表达水平，改善糖尿病肾脏病理损伤，延缓糖尿病肾病进程，发挥肾脏保护作用。本实验欠缺之处在于仅选用预实验7 天起效的时间点，对血糖的影响还需长时间监测，后面有长期实验进一步阐明其作用机理，为糖尿病肾病的临床干预和治疗提供新的理论和实验依据。