CD133与CD44蛋白在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

2019-03-21张国平刘贵平谷从阳

西南医科大学学报 2019年5期

敬敏，张国平，吴欢，王瑜，刘贵平，谷从阳

（内江市第一人民医院：1病理科；2肝胆外科，四川内江 641000）

我国肝癌的发病率居世界首位[1]，HCC为主要病理类型，这与我国HBV感染有关。手术治疗近期疗效确切，但肿瘤复发和转移严重影响其远期疗效[2]。因此寻找影响HCC 进展的基因及蛋白分子对提升临床疗效十分重要。近年的研究表明肿瘤组织中存在的肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是影响肿瘤形成及侵袭转移的重要原因[3]。肝癌干细胞(1iver cancer stem cells，LCSCs)是存在于HCC 组织中的CSCs，与HCC 的形成、进展及复发相关[4-5]。CD133是LCSCs的标记物之一，在HCC组织中高表达，与肿瘤的复发和转移相关[6]。CD44是另一种LCSCs的表面标记分子，其表达与肿瘤的分期有关,并可影响肿瘤的发生发展[7]。本研究通过检测43例HCC组织中CD133和CD44蛋白的表达，探讨其与临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2015年6月至2018年9月经本院肝胆外科手术切除并经病理确诊的43 例HCC 患者的肿瘤组织标本，其中男性24 例、女性19 例、年龄47～75 岁、中位数年龄61岁。所有患者均有HBV感染背景，行手术切除前未接受肿瘤相关的其他治疗。病例随访至死亡或截止时间为2018 年9 月，共随访3～36 月。入选病例均有完整的临床及随访资料。临床资料包括年龄、性别、肿瘤直径、甲胎蛋白量、分化程度、门脉癌栓及临床分期。收集癌旁组织（距肿瘤距离均＞2 cm）标本36例作为对照。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂

CD133 单克隆抗体（鼠抗人）购自Santa Cruz 公司，CD44 单克隆抗体（鼠抗人）购自北京中杉金桥公司，DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。其他所需试剂如蒸馏水、双氧水等由内江市第一人民医院病理科提供。

1.2.2 免疫组化

所有标本经常规固定、包埋，4 μm 连续切片。按试剂说明的操作步骤进行CD133 和CD44 分子的免疫组化检测。设阳性对照（试剂公司提供的阳性切片）和阴性对照（PBS代替一抗）。

1.3 结果判定

CD133和CD44蛋白均定位于细胞膜，染色呈棕黄色着色。随机选择5 个高倍视野（×40）计算阳性细胞数所占的百分比。＜30%为弱阳性，30%～60%为阳性，＞60%为强阳性，无阳性细胞为（-）。免疫组化结果由2 位病理科主治医师独立进行观察判断，结果不一致时共同观察切片。

1.4 统计学分析

采用统计软件SPSS 19.0 对数据进行统计学处理，计量资料均以±s表示，两个样本均数比较采用t 检验，计数资料用χ2检验，采用Kaplan-Meier 方法作生存分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化SP 法观察CD133 蛋白在HCC 组织中的表达

HCC 中CD133 主要表达于细胞膜，呈棕黄色颗粒着色（图1），阳性表达率58.1%（25/43），高于在癌旁正常肝组织中的表达19.4%（7/36），差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。临床特征分析提示CD133 蛋白的表达与肿瘤直径、分化程度及门静脉癌栓形成有关；临床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者CD133蛋白表达高于Ⅰ+Ⅱ期患者（P＜0.05），但与患者年龄、性别及甲胎蛋白无明显相关性（P＞0.05），见表2。

表1 CD133蛋白在HCC及癌旁组织中的表达情况

2.2 免疫组化SP 法观察CD44 蛋白在HCC 组织中的表达

HCC组织中CD44蛋白表达于细胞膜，呈线性棕黄色着色（图2），阳性表达率69.8%（30/43），高于癌旁肝组织的22.2%（8/36），两组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。CD44 蛋白的表达与临床分期（Ⅲ+Ⅳ期高于Ⅰ+Ⅱ期）及门静脉癌栓形成有关（P＜0.05），与性别、年龄及甲胎蛋白含量无明显相关性（P＞0.05）。CD44的表达与肿瘤分化程度及大小无明显关系，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

图1 CD133在HCC中的表达（×200）

图2 CD44在HCC中的表达（×200）

表2 CDl33和CD44蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系

2.3 生存分析

随访时间3～36 月，平均25 月。随访期间肿瘤复发、转移28 例，死亡16 例。采用Kaplan-Meier 方法作生存分析比较3年总体生存率。CD133阳性表达组（40%）低于阴性表达组（72.2%）(P＜0.05），见图3；CD44蛋白阳性表达组（43.3%）也低于阴性表达组（76.9%）（P＜0.05），见图4。

表3 CD44蛋白在HCC及癌旁组织中的表达情况

3 讨论

HCC是我国肝癌患者的主要病理类型，与HBV感染、肝硬化的序惯性改变有关。手术切除为其主要的治疗方式，但术后易复发、转移，严重制约临床疗效的提高[8]。因此寻找肝癌进展的基因及治疗靶点对临床早期诊断及提升治疗效果具有重要意义。CSCs是近年该领域的研究热点，与肿瘤的形成及演变发展密切相关。

图3 CD133阳性表达的生存曲线

图4 CD44阳性表达的生存曲线

CD133 是肿瘤干细胞特征性标志物，定位在人类4号(4p16.12.p1)和2号染色体上，是一种5次跨膜的细胞表面糖蛋白，与肿瘤细胞间存在密切的联系[9]。已有的研究提示CD133的表达与多种恶性肿瘤患者的预后具有相关性[10-11]。在肝癌中的研究也表明CD133的表达与肝癌的分化程度及临床分期呈负相关关系[12]。在本组研究中CD133在HCC组织中的阳性表达为25 例（58.1%），明显高于癌旁组织7 例（19.4%），两组间差异有统计学意义。提示CDA133是HCC细胞较特异的表面标志物，并在肝癌的成瘤过程中发挥作用。通过对临床病理特征的分析发现CD133的表达与患者年龄、性别、甲胎蛋白等无明显相关性；与肿瘤直径、临床分期及门脉癌栓形成的有关。提示CD133蛋白的高表达与肿瘤的侵袭性高有关，这与CD133 在其他肿瘤中的研究结果类似[13]。进一步的生存分析也显示CD133 阳性组的HCC 患者3 年生存率低于阴性，提示CD133 的表达与HCC患者的生存时间相关。

CD44是另一种LCSCs的表面标记分子，具有介导淋巴细胞归巢、向炎症部位侵化及黏附细胞外基质等作用[14]。目前较多的研究表明CD44 基因表达的上调可导致肿瘤细胞增殖、侵袭及转移功能的增强，这与CD133在肿瘤组织中的作用具有相似性[15]。本研究应用免疫组化法检测HCC 和癌旁组织中CD44 蛋白的表达，结果显示CD44 蛋白定位于HCC细胞膜，呈线性棕黄色着色，其阳性细胞呈分散或簇状分布在肝癌组织中。在43例HCC组织中CD44表达阳性为30 例（69.8%），高于癌旁组织8 例（22.2%），两组差异有统计学意义，提示CD44 是HCC 细胞较特异的表面标志物，并在肝癌的成瘤过程中发挥作用。临床特征分析提示CD44 的阳性表达与HCC 的临床分期及门脉癌栓形成有关。生存分析结果显示CD44 阳性组患者3 年总体生存率低于阴性组，两组间差异有统计学意义，这与CD44 在消化系统的其他肿瘤中的研究结果类似[16]。