HPLC法快速测定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量

朱链链，王丽琼

（1乐山职业技术学院药学系；2乐山市食品药品检验检测中心，四川乐山 614000）

良附丸主治温胃理气。用于寒凝气滞，腕痛吐酸，胸腹胀满。有研究显示对胃脘痛的治愈率高[1]，能提高脾胃虚寒型消化性溃疡的治疗效果[2]，化疗联合加味良附丸可提高晚期胃癌患者的生活质量[3-4]。处方为高良姜和醋香附两味药材。高良姜的主要成分有高良姜素、槲皮素、异鼠李素和山奈素，其中，高良姜素含量最高[5-6]，《中国药典》2015 年版一部“高良姜”药材以“高良姜素”为含量控制指标。卢君蓉等建立了良附丸的HPLC 指纹图谱评价体系[7-8]，魏娜等对高良姜正丁醇萃取部位化学成分进行研究[9]，陈凌霄等采用顶空固相-微萃取-气相色谱质谱联用分析比较鲜/干高良姜挥发性成分[10]。挥发油为香附的主要活性成分[11]。陈雅兰等[12]、曹庆玺等[13]、陈华师等[14]、韩晓萍等[15]、王红等[16]、王浩浩等[17]、吕霞等[18]等对香附及其制剂的研究中均以α-香附酮为指标。综上，高良姜素和α-香附酮是良附丸的主要质量指标，现行标准[19]鉴别项采用高良姜对照药材薄层对比，含量测定采用HPLC法控制α-香附酮含量，标准还不够完善，缺少高良姜的控制内容。本文采用常规C18柱，简单二元流动相等度洗脱，直接超声提取，建立快速测定良附丸中高良姜素和α-香附酮含量的质量控制方法，为有效快速控制良附丸质量提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪，DAD 检测器(美国)；XS205梅特勒-托利多电子天平(瑞士)；CQ-100B超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；16K台式离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)。

图1 对照品溶液(A)和良附丸(B)色谱图

对照品高良姜素（Lot:DST170215-020，≥99%，成都德思特生物技术有限公司）、α-香附酮对照品(110748-201513，中国食品药品检定研究院，99.7%)。良附丸(市售，批号17081049 CC、17081104 KP、1708105 CC)。甲醇（色谱纯，分析纯），磷酸（分析纯）试验用水（纯化水）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XTerra C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长：249 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃。对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图1，高良姜素、α-香附酮与相邻峰分离度符合要求。

2.2 对照品溶液制备

取对照品高良姜素48.62 mg和对照品α-香附酮11.64 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备溶液；精密吸取对照品贮备溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取本品，粉碎，取粉末约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。

2.4 定量限试验

分别精密称取高良姜素和α-香附酮对照品，加甲醇使溶解并稀释制成系列浓度的溶液，按“2.1”方法进样分析。根据信噪比（S/N）=10，得两组分定量限分别为0.27 μg/mL和0.13 μg/mL。

2.5 线性与范围考察

精密吸取“2.2”对照品溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性第一点溶液；精密吸取“2.2”对照品溶液2 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性第二点溶液；分别精密量取“2.2”对照品贮备溶液2、4、8 mL，分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性系列浓度的标准溶液；精密量取线性第一点溶液、线性第二点溶液、对照品溶液和线性系列浓度的标准溶液共6个溶液各10 μL，照“2.1”色谱条件测定峰面积。分别以两组分浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：高良姜素Y=25.208 X-15.259（r=0.9999，n=6），范围9.72～777.92 μg/mL；α-香附酮Y=33.382 X+12.717，（r=0.9999，n=6），范围2.32～185.68 μg/mL。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果RSD(n=6)分别为高良姜素0.4%，α-香附酮0.9%，显示精密度良好。

2.7 重复性试验

取批号为“17081049 CC”的良附丸，照“2.3”项方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样测定。结果高良姜素和α-香附酮的质量分数分别为3.40 mg/g 和0.67 mg/g，RSD(n=6)分别为1.7%和1.5%，显示重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取6 份已知含量的样品（批号17081049 CC，测得高良姜素、α-香附酮的含量分别为3.40 mg/g 和0.67 mg/g）约0.75 g，精密称定，分别精密加入“2.2”项下对照品贮备液2.5 mL，按“2.3”项方法制备，精密吸取以上6种溶液各10 μL进样测定，计算加样回收率，结果见表1，表明加样回收率良好。

表1 回收率试验结果

2.9 稳定性试验

取“17081049CC”批样品，按“2.3”项下方法处理，室温条件下分别于0、2、4、6、8、12、24 h 进样10 μL，记录峰面积。结果RSD（n=7）分别为高良姜素0.9%，α-香附酮0.4%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.10 含量测定

精密称取3 批良附丸，每批平行测定3 份，照“2.3”方法制备样品溶液，照“2.1”色谱条件测定，采用外标法计算，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

根据高良姜素和α-香附酮的紫外光谱图进行分析，高良姜素在267 nm波长处有最大吸收，在249 nm 波长处有最小吸收；α-香附酮在249 nm 波长处有最大吸收。波峰和波谷处曲线平缓，适用于作为测定波长，考虑样品中α-香附酮浓度较小，选择249 nm波长较为合适。

以校正因子（单位浓度的峰面积）为指标，比较提取方法①（取样品约6 g，甲醇25 mL，超声30 min）、方法②（取样品约6 g，甲醇25 mL，超声60 min）、方法③（取样品约6 g，甲醇25 mL，超声120 min）和方法④（取样品约1.5 g，甲醇50 mL，超声60 min）对两组分提取能力的影响。结果表明采用方法④时，提取完全。

本实验采用HPLC法快速测定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量，实验中采用常规的C18色谱柱，直接超声提取，过程简单，色谱分析时间短。通过方法学验证，方法专属性高、精密度好、准确度高、简单快速，可作为快速测定良附丸含量得方法。通过对同一个厂家3 个批次样品进行检验，高良姜素的含量为3.377～3.579 mg/g，α-香附酮的含量为0.675～1.252 mg/g，高良姜素的质量较稳定，α-香附酮的质量波动范围较大，可能与香附产地不同相关[20]，但是对于制定良附丸中高良姜素和α-香附酮的含量控制限度，样本量远远不够，可考虑收集更多的样本，制定良附丸的质量标准。