柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎大鼠肝肾损害的保护作用

2019-03-21肖国辉王天刚陈珊珊

西南医科大学学报 2019年5期

吕瑶,肖国辉,王天刚,陈珊珊,赵龙

（西南医科大学：1中西医结合学院；2附属中医医院脾胃病科，四川泸州 646000）

作为消化系统的危急重症之一，重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)的病因与诊治经历了长时期的探索，尽管近年来其病死率明显下降，但我们对其发生发展的机制尚未完全明确，治疗也是临床上的一大难点；因其不仅是胰腺自身的炎症，更是引起全身多个脏器损害的全身性疾病，可引起多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syn⁃drome，MODS)、全身炎症反应综合征(systemic in⁃flammatory response syndrome，SIRS)等。SAP 发病过程中多并发肝肾损害，且发生较早。Halonen 等[1]在一项回顾性研究中发现：重症急性胰腺炎并发肝损伤的比率很高，达88.9%，并且以肝、肾功能衰竭最为严重，死亡率最高。柴黄清胰活血颗粒具有泻热通腑、清热解毒、行气止痛、活血化瘀的功效。其临床疗效明确，前期实验证实，柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠有明显的治疗作用[2]。本实验通过探讨柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺及胰外器官（肝、肾）的治疗作用，为该药的临床运用和新药研究提供理论基础及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD 大鼠54 只，10 周龄，体重为280～320 g[购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2015-030]。

1.2 实验药物及剂量

柴黄清胰活血颗粒主要由生大黄、柴胡、黄芩、栀子、枳实、厚朴、桃仁、赤芍、蒲公英等十四味组成，成药由西南医科大学附属中医医院制剂室研制提供。批号:20181015。按照公式：大鼠剂量（g/kg）=W×人体剂量（g/kg）,W=6.25，成年人体重取60 kg，一次10 g,换算得出：大鼠常规使用剂量为：0.1 g/100 g,根据前期实验证实：柴黄清胰活血颗粒疗效呈剂量依赖性，其中高剂量组疗效更好，本次实验直接采用高剂量（0.2 g/100 g）作为中药组（CHQY 组）使用剂量[1]。

1.3 试剂

牛磺胆酸钠(Solarbio 公司，批号:20171113)，配制成3.5%牛磺胆酸钠溶液。苏木素染液(北京百灵威科技有限公司，批号：20160114)，4%多聚甲醛中性固定液（biosharp公司,批号：1810473）等。

1.4 实验方法

大鼠适应性喂养1 周后随机分为3 个组，即sham 组、SAP 组、CHQY 组，每组分为6 h、12 h、24 h三个时点，每个时点6 只，术前禁食12 h,自由饮水。Sham 组开腹后仅翻动肠管即关闭腹腔。SAP 组及CHQY组采用经十二指肠逆行胰胆管注射3.5%牛磺胆酸钠建立重症急性胰腺炎模型。具体方法：大鼠称重，用3%戊巴比妥钠液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉满意后固定于手术台，腹部剃毛，消毒,铺巾，沿腹部正中线剑突下作1条长约3 cm 手术切口开腹，找到十二指肠及胰腺，用动脉夹夹闭肝总管防止牛磺胆酸钠进入肝脏，用4.5号磨钝皮试针头沿十二指肠乳头对侧十二指肠偏下方无血管区缓慢进入胰胆管，动脉夹夹闭针头入胰胆管处防止反流，缓慢匀速注射牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g）,注射完毕后取出动脉夹并逐层关腹，术后予以皮下注射生理盐水（4 mL）补充术中失水，术后予以保暖。麻醉苏醒后，Sham 组与SAP 组予以灌胃生理盐水（1 mL/100 g）,CHQY组予以灌胃柴黄清胰活血颗粒（0.2 g/100 g，并用生理盐水稀释为1 mL/0.2 g），每组每4 h灌胃1次。

1.5 标本采集

分别在术后6 h、12 h、24 h各处死6只大鼠并取材，取腹主动脉血约3～5 mL，静置1 h后离心，取血清存于-20 ℃冰箱以备检测AMS、AST、ALT、Scr、BUN；分别取胰腺、肝、肾，用冰生理盐水冲洗后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，以备HE染色，行病理检查。

1.6 指标测定

血清AMS、AST、ALT、Scr、BUN均由西南医科大学附属中医医院检验科全自动生化分析仪检测。胰腺、肝、肾组织进行组织脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、树胶封片，最后在光镜下观察，进行病理学评分。胰腺病理评分采用Rongione评分标准[3]：按照水肿、炎症浸润、出血、坏死四个方面进行评分，每个方面根据严重程度分别评0分、1分、2分、3 分、4 分。肝、肾病理评分参考田在善[4]的标准，按严重程度分为正常、轻、中、重，分别评0 分，1 分，2分，3分。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠血清淀粉酶活性变化

与Sham 组相比，SAP 组及CHQY 组在各个时点血清淀粉酶活性均显著升高（P＜0.05）；与SAP组比较，CHQY 组6 h 组淀粉酶活性无差异，12 h、24 h 差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

表1 三组大鼠不同时间点血清淀粉酶比较(±s，U/L)

注：a与Sham组相比，P＜0.05；b与SAP组相比，P＜0.05

2.2 大鼠血清AST、ALT活性变化

与Sham 组各时点比较，SAP 组、CHQY 组AST、ALT活性均明显升高（P＜0.05），CHQY组12 h、24 h与SAP 组相应时点比较，血清ALT 水平明显降低(P＜0.05)。与SAP 组比较，CHQY 组各时点AST 水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

表2 三组大鼠不同时间点血清AST、ALT比较(±s，U/L)

注：a与Sham组相比，P＜0.05；b与SAP组相比，P＜0.05

2.3 大鼠血清BUN、Scr活性变化

与Sham 组各时点比较，SAP 组、CHQY 组BUN、Scr 活性均明显升高（P＜0.05），CHQY 组12 h、24 h与SAP 组相应时点比较，血清BUN 水平明显降低（P＜0.05）。与SAP 组比较，CHQY 组各时点Scr 水平均降低（P＜0.05）。（见表3）

表3 三组大鼠不同时间点血清BUN、Scr比较(BUN:±s，mmol/L，n=6;Scr:±s，μmol/L)

注：a与Sham组比较，P＜0.05；b与SAP组比较，P＜0.05

2.4 剖腹后大体观察

Sham组各时点大鼠腹腔无明显积液，肠腔无充气，胰腺无充血、水肿及坏死，未见皂化斑，胰腺与周围组织轻微粘连。SAP组各时点大鼠腹腔大量红黄色积液，肠管肿胀充血，胰腺肿胀、坏死、充血，胰腺及腹腔网膜可见大量黄白色皂化斑，胰腺与肝、脾、肠管粘连明显，且随时间的推移加重。CHQY 组各时点腹腔积液较SAP组减少，胰腺肿胀、充血较SAP组有所减轻，胰腺周围及网膜可见少量皂化斑，胰腺与周围器官组织粘连。

2.5 胰腺病理组织学观察

Sham组各时点大鼠胰腺除个别有轻度水肿，少量炎细胞浸润，大部分胰腺结构基本完整，未见水肿、出血、坏死（见图1）。SAP 组大鼠胰腺水肿，胰腺腺泡坏死，小叶结构破坏，出现分隔小叶，胞浆内可见空泡形成，坏死区周围可见大量中性粒细胞及单核细胞浸润；胰腺间质内可见大量的红细胞渗出、大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，且随时间的推移，胰腺的炎症程度加重（见图2～4）。CHQY 组各时点大鼠胰腺轻微水肿，部份胰腺腺泡坏死，结构稍模糊，坏死周围炎症细胞浸润较SAP 组轻，胰腺间质内可见少许红细胞浸润（见图5～7）。

图1 Sham组(HE染色×400)

图2 SAP组6 h(HE染色×400)

图3 SAP组12 h(HE染色×400)

图4 SAP组24 h(HE染色×400)

图5 CHQY组6 h(HE染色×400)

图6 CHQY组12 h(HE染色×400)

图7 CHQY组24 h(HE染色×400)

2.6 胰腺组织病理学评分

SAP 组各时点胰腺病理学评分显著升高（P＜0.05），且随时间的推移严重程度越重，组间差异有统计学意义（P＜0.05），CHYQ组12 h、24 h与SAP组对应时点比较，胰腺组织的病理学评分明显降低（P＜0.05），6 h 比较差异无统计学意义（P＜0.05），（见表4）。

表4 三组大鼠不同时间点胰腺组织病理学评分(±s)

注：a与sham组相比，P＜0.05；bSAP组相比，P＜0.05

2.7 肝、肾组织的病理学观察

正常组大鼠肝组织可见肝小叶结构清晰，细胞排列整齐，无空泡、出血、坏死及炎细胞浸润（见图8）。SAP 组可见细胞排列紊乱，肝小叶结构模糊不清，大量空泡形成，可见坏死细胞、充血及炎细胞浸润，血窦扩张，肝索排列紊乱（见图9～11）。CHQY组大鼠肝组织空泡及坏死均减少，肝小叶结构稍紊乱，渗出及浸润较SAP 组明显减少（见图12～14）。Sham组大鼠肾小管和肾小球结构清晰、肾间质无水肿、肾皮质组织结构完整，无或少量炎细胞浸润，无充血及坏死（见图15）；与假手术组比较，SAP组大鼠肾小球萎缩，大量炎细胞及红细胞浸润，肾小管管腔内大量淤血，管型形成，肾小管管腔变窄（见图16～18）；CHQY 组大鼠肾皮质细胞损伤减轻，肾小球萎缩、红细胞及炎细胞浸润、肾小管管腔变窄、管型形成等病理损害较SAP组减轻（见图19～21）。

图8 Sham组(HE染色×100)

图9 SAP组6 h(HE染色×100)

图10 SAP组12 h(HE染色×100)

图11 SAP组24 h(HE染色×100)

图12 CHQY组6 h(HE染色×100)

图14 CHQY组24 h(HE染色×100)

图15 Sham组(HE染色×100)

图16 SAP组6 h(HE染色×100)

图17 SAP组12 h(HE染色×100)

图18 SAP组24 h(HE染色×100)

图19 CHQY组6 h(HE染色×100)

图20 CHQY组12 h(HE染色×100)

图21 CHQY组24 h(HE染色×100)

2.8 肝、肾组织的病理学评分

SAP 组各时点肝组织、肾组织病理学评分较Sham组明显升高（P＜0.05）。CHYQ组6 h、12 h、24 h与SAP 组对应时点比较，肝组织的病理学评分明显降低（P＜0.05）。CHQY 组12 h、24 h 与SAP 组对应时点比较，肾组织的病理学评分降低（P＜0.05）（见表5）。

表5 三组大鼠不同时间点肝肾组织的病理学评分(±s)

注：a与Sham组比较，P＜0.05；b与SAP组比较，P＜0.05

3 讨论

SAP 极容易合并多器官功能损害，其中肝肾损害，尤其是肝衰竭、肾衰竭是其中最常见、最严重的胰外器官损害,是导致SAP 患者死亡的最主要原因之一。研究表明，SAP 的严重程度与肝损伤的严重程度呈正相关，肝损伤不仅能加重SAP的炎症反应，并且对其余器官，如肾和肺的损伤起着促进作用[4]。关于SAP能并发严重的肝损伤主要是基于以下3个原因:首先胰腺与肝脏相邻，胰腺的大量炎性渗出液波及肝脏导致肝损伤；其次肝脏是全身血流最丰富的器官，SAP 病程中产生的大量炎性细胞因子及内毒素等通过静脉血流入肝脏，加重肝脏的损伤；最后肝脏是全身最大的代谢及解毒器官，肝实质的损害导致肝脏对炎症介质及细胞因子的解毒和清除作用明显下降，进一步加重病情[5]。SAP并发肾损害的机制尚未完全明确，过去认为与SAP 发病过程中有效循环血容量不足及微循环障碍，肾脏灌注不足所引起的缺血性损伤有关，近年来研究表明，SAP并发肾损害主要是由于SAP 致大量促炎因子释放进入血液，引起强烈的全身炎症反应综合征（SIRS）所致[6]，若发展至急性肾衰竭（ARF）后预后更差。因此，有效地预防或减轻肝肾功能的损伤对改善重症急性胰腺炎患者预后和提高生存率具有重要意义。

SAP 组各时点大鼠剖腹后腹水明显增多，胰腺肿胀、充血，腹腔脏器粘连明显，网膜见大量皂化斑，血清AMS显著升高，胰腺病理学评分升高，提示SAP模型成功建立。SAP 组ALT、AST、BUN、Scr 较Sham组显著升高，肝组织及肾组织病理学评分升高，提示该SAP模型并发肝肾损害。CHQY组大鼠剖腹后腹腔腹水、网膜上的皂化斑较SAP 组减轻，血清AMS及胰腺病理组织学评分均低于SAP 组，提示柴黄清胰活血颗粒能改善胰腺组织的病理学评分，对SAP模型大鼠具有治疗作用。AST、ALT、BUN、Scr 是分别反应肝肾功能损害程度的重要指标，CHQY 组大鼠血清的AST、ALT、BUN、Scr值均降低，病理学观察发现CHQY组肝小叶坏死、炎细胞浸润、肝小叶结构紊乱等均较SAP 组减轻；CHQY 组的肾组织肾小球萎缩程度、红细胞及炎细胞浸润等病理损害均较SAP组减轻。可见柴黄清胰活血颗粒能改善SAP模型大鼠的肝肾损伤，对多器官功能具有保护作用。

SAP 属于中医“胃脘痛”、“腹痛”、“胁痛”等范畴，中医临床诊疗术语疾病部分国家标准称之为“胰瘅”。SAP 早期主要临床表现为：腹痛、恶心、呕吐、腹胀、肛门停止排便排气及腹膜炎等，这与《伤寒论》描述的阳明腑实证—痞、满、燥、实、坚等证候相吻合。经过多年临床实践总结，目前多数医家认为其病机为湿热壅滞、腑气不通、毒瘀互结。其中湿热壅滞是重症急性胰腺炎最主要的病理机制。针对急性胰腺炎的主要病机，我院脾胃病专家、四川省名中医周德端教授提出了“通腑泻热解毒、除湿散瘀止痛”的治疗原则，在此法的指导下形成了中药综合治疗方案：用胰瘅1 号、胰瘅2 号管胃（口服）、灌肠，配合西医基础治疗，临床疗效确切，能缩短病程、减少并发症，降低病死率，值得进一步研究和推广[7]。为了更好的总结周德端教授治疗SAP的学术思想和用药规律，提供更安全可靠、简便有效的治疗药物，现已将该方制成颗粒制剂—“柴黄清胰活血颗粒”。方中以生大黄为君药以泄热通腑；柴胡为臣药以疏肝行气；黄芩、栀子、蒲公英清热解毒；枳实、厚朴助柴胡、大黄下气消胀；延胡索理气活血；丹参、桃仁、赤芍活血祛瘀；白芍缓急止痛，黄芪益气托毒，甘草为使药调和诸药。诸药合用，共奏泻热通腑、清热解毒、行气止痛、活血化瘀之功。现代药理研究表明，方中所含药物大多具有抗炎、抗菌的作用，对SAP有确切的治疗作用。大黄游离蒽醌类物质是大黄的主要活性成分，有研究表明大黄游离蒽醌能抑制全身炎症反应，减轻肝脏损伤,对重症急性胰腺炎所致的肝损伤有保护作用[8]。厚朴的主要作用成分为厚朴酚、和厚朴酚，陈银芳等人发现大黄素、芦荟大黄素、厚朴酚、和厚朴酚的组方对AP大鼠有明显治疗作用,因其能够调节NF-κB 蛋白的表达，抑制炎症反应[9]。另有研究表明黄芩具有抗炎、抗菌、抗氧化、增强机体免疫的作用[10]。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷也具有解热、镇痛、抗菌、抗炎的作用，还可以通过对信号通路的调控,达到抗肝损伤的作用[11]。