多组织对照体系建立及在免疫组化染色的应用

陈培琼 钟山 王玉环

随着精准医疗的来临，免疫组化已成为病理医生重要辅助诊断手段[1]，在病理诊断中的作用日益广泛。如今，免疫组化技术不仅用于协助肿瘤组织学分类的诊断、肿瘤来源的确定，而且还越来越多的作为判断预后及指导临床个性化治疗的指标[2-3]。因此免疫组化染色的可靠性、正确性、稳定性至关重要[4]。免疫组化的染色过程较复杂，很多因素可对染色结果产生不同程度的影响。因此，需要建立合格的实验对照。目前病理科常用的实验对照有几种形式：（1）单组织对照；（2）组织芯片对照；（3）“香肠技术”的多组织对照；（4）样本中的内对照。作者在日常免疫组化染色工作中总结了上述几种形式对照的利弊，摸索出了多组织对照方法，并建立多组织对照体系，取得了令人满意的效果。现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取本院各临床科室送检的阑尾、结肠、胰腺、肺、甲状腺、胎盘、扁桃体、脑、皮肤等组织，10%中性福尔马林固定，按照常规组织的脱水，浸蜡和包埋，选取病理诊断明确的剩余的组织蜡块进行实验。

1.2 多组织对照体系的构建

结合日常工作中各抗体使用频率、组织获取难易度等因素，多次调整优化组合，设计了4组多组织对照体系（见表1），覆盖面广，涵盖多种抗体，以达到组织耗费少、操作简便、对照效果好的目的。

1.3 多组织对照蜡块制备前准备工作

取材蜡块先经过HE染色，镜下观察组织形态，选取部位，例如：肺组织应含有正常肺泡结构，扁桃体组织应含被覆鳞状上皮及淋巴小结等。将HE片上符合要求部位作标记，然后比对蜡块圈出相应部位。

1.4 多组织对照蜡块制备

选取上述经过画圈标记的组织蜡块，放65℃烤箱5分钟，软化蜡块，采用多组织对照点样器（见图1A）进行取材，该点样器由作者自行设计，不锈钢定制加工而成。多组织对照点样器的针头垂直在蜡块上加压，拔出点样器、用内芯推出所取样组织。所取组织外观圆形条状，直径3 mm。3～5个组织一起包埋（类似包埋小标本），制成多组织对照蜡块（见图1B）。

1.5 多组织对照切片制备、染色

对多组织对照蜡块进行连续地切片，裱于干净的防脱载玻片上端，标明对照体系的类型，将待测组织切片后裱于下端，两者距离适中。65℃烘烤1 h后上机，进行免疫组织化学染色。

2 结果

阳性对照染色理想，不同抗体在不同组织中具有不同定位及染色强度，由于在同一张玻片进行所有染色，便于读片医生做出更可靠的判断。

4组多组织对照体系的建立，经多次验证可为我科160多种抗体提供稳定可靠的阴阳性组织对照片，基本满足工作需要。

4组体系基本满足常用临床诊断抗体质控，每种抗体加了对照片，在日常的质控中，就易发现实验是否成功，并找出假阴性或假阳性的原因。图2、图3（多组织对照免疫组织化学染色举例）。

3 讨论

为保证病理诊断中免疫组化结果的可靠性，每种抗体每张切片的染色都应进行有效的质控，设立稳定的对照并合理运用是质控的关键[5]。免疫组化染色的对照包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照、内对照[6]。其中，阴性试剂对照是针对内源性生物素设立的，一旦完成试剂最初校验，就可以取消阴性试剂对照[7]。本文所介绍的多组织对照囊括了阳性组织对照、阴性组织对照及内对照。内对照又包括内部阴阳性对照，是每一张被测试的组织切片上都存在的细胞成份，可确认组织固定、包埋步骤的可靠性。在免疫组化染色中使用对照是保证质控的最有效的方法[8]。

表1 多组织对照各点组织的抗体阳性表达对照情况

图1 1A是多组织对照点样器 ；1B是多组织对照蜡块；图2 2A为扁桃体组织的CD3 细胞膜阳性（4×10）；2B为扁桃体组织的 Ki67细胞核阳性（4×10） ；图3 3A为扁桃体组织的CK5/6 细胞质阳性（4×10）；3B为皮肤组织的P63细胞核阳性（10×10）

作者发现单组织对照[8]制作简单，虽组织获取方便，但由于标记覆盖面不够广，常需要准备大量用于各种标记类型的组织蜡块，对于不常用的组化，常是医生觉得有需要时提出加对照，技术员临时制作，查片、阅片、找蜡块耗费时间巨大。并且单组织对照蜡块常使用已知抗原表达较强的组织，相对于抗原表达较弱的检测组织就容易产生假阴性。组织芯片对照[9]抗体覆盖面最广，且高通量，但制作起来需要专门的仪器，对制作过程要求高，包埋易形成空泡，由于组织量小、细胞数量少，大量连续切片阳性率不稳定，同一平面常无法切全。平常工作中片子很多，动辄上千张，应用起来成本巨大，难以推广到日常，一般用于科研。香肠技术是运用多种组织制作香肠包埋块阳性对照切片[10]，效果较好，但对照组织面积大，消耗试剂多，要从取材固定开始做起，制作过程烦琐。

现今，全自动免疫组化仪[11]普及，对技术人员提出更高要求：要为机器设定最佳的染色程序。在实验过程中作者无法观察到染色的全过程，而此过程中可能出现滴加抗体量不足、混匀不均，冲洗不净、出现气泡、温度下降等现象，会影响实验结果的准确性。因此作者设计了多组织对照点样器，建立多组织对照体系，制作多组织对照蜡块，对整个染色流程及机器严格精确把控，为病理诊断提供高质量的免疫组化染色片，确保染色结果可靠稳定。现总结如下：

（1）多组织对照与待测组织在同一张切片上进行染色，实现了实验条件的一致性，同时有阴阳性对照，染色结果可靠、准确，为免疫组化染色的规范化、标准化奠定基础。切片也可直接归档保存，不需要单独保存阳性对照切片。

（2）多组织对照分组的设计灵活多变，可根据不同需要设计出不同的多组织对照体系。一般选择三五个对照组织，兼具抗体覆盖面和实际操作，更为方便。 对大量抗体进行检测时可避免假阴性、假阳性的风险。

（3）用多组织照点样器取样，简便易行。所取蜡块也是病理诊断明确的剩余组织蜡块，与待测组织的前处理一致。此外多组织点样器内径大，所取组织直径3 mm，大于组织芯片，可提高了取样的准确性、便于组织包埋，特别利于肿瘤与正常组织交界处的取样、方便医生阅片。此外通过对多组织对照表达情况的观察，可能会发现一些抗体在不同组织上的应用。

综上，多组织对照点样器设计简单，成本低廉，容易操作，经过合理设计的多组织对照体系耗费少、实用性强、效益性高、可操作性和重复性好，质量可靠稳定，可推广至病理科日常工作中，运用于免疫组化染色质控中，为室内及室间质量控制带来稳定、便利，提高了整个免疫组化染色技术的质控水平。