蛋白质组学分析在复发性流产患者不同临床标本中的应用

张文倩，王玉霞，左萌，徐丹

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指与同一性伴侣连续发生2次或2次以上的胎儿丢失[1]。引起RSA的原因众多，主要包括染色体异常、免疫功能异常、遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、血栓前状态、孕妇的全身性疾病及环境因素等[2]。除此之外，在临床上仍有高达半数的病例病因不明，其妊娠丢失的病因及相关的分子学机制仍无法解释，被称为原因不明复发性流产（URSA）[3]。因此，为了系统和全面地研究RSA的病因，寻求更有效的治疗方案，蛋白质组学的研究方法越来越多地应用于该疾病的病因学研究中。

蛋白质组学是为了补充基因组学而出现的一个新的研究领域，主要研究细胞、组织、器官等中蛋白质的表达、翻译后修饰和相互作用。大多数学者一致认为，蛋白质组学的研究使人类能深入了解某一特定时刻组织、细胞或生物体中蛋白质功能表达[4]。虽然基因组学可以在基因活性和疾病相关性方面为人类提供有力证据，但很多疾病并非仅仅是由于基因改变引起的。人类基因组中大约只有3万个基因，却可以编码超过50万个蛋白质，99.9%的人在基因水平上是相同的[5]。但基因在不同条件及时机的表达有差异，同样的基因在不同情况下编码的蛋白质功能更是千差万别。与基于DNA/RNA的技术相比，蛋白质组学的主要优势就是直接研究蛋白质的功能。因此，从蛋白质组学分析中获得的数据比依赖于DNA或mRNA研究的基因组学的结果更具有临床相关性，也更容易转化为诊断工具和治疗手段。

在蛋白质组学的研究中，主要有三大基础技术支持，包括二维凝胶电泳（2-DE）技术、质谱（MS）技术和生物信息学技术。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术与MS技术的联合应用已成为蛋白质定性和定量研究的主要工具之一[6]。最初，蛋白质组学的技术主要应用于药物研究和肿瘤学领域，后来又逐渐应用于心血管、神经系统和肾病等各种临床疾病的诊断。在妇产科疾病的应用中，主要包括滋养细胞疾病、卵巢肿瘤、子宫内膜癌、妊娠期高血压疾病、子宫内膜异位症、流产和多囊卵巢综合征等。因此，对于RSA这样尚未完全明确病因的疾病，蛋白质组学分析可以为其发病机制和临床早期诊断提供一些新的思路，从分子水平上探索其发病机制，寻找可用于早期诊断的生物标志物，更精确地预测妊娠结局。

1 常用于进行蛋白质组学分析RSA患者的体液与组织

随着样本制备方法的提高和MS技术的发展，越来越多的体液和组织都可以被用于进行蛋白质组学分析。目前能用于检测的生物体液和胎儿组织有很多，常见的包括血液、玻璃体液、脑脊液、滑膜液、乳汁、精液、羊水、宫颈及阴道分泌物、尿液、唾液、胎盘绒毛、羊膜和脐带血等[7-8]。以下主要阐述卵泡液、胎盘绒毛、子宫内膜和血液的蛋白质组学研究结果与RSA发生、发展的相关性，分析蛋白质组学应用于临床RSA诊断治疗的发展前景。

1.1 卵泡液 卵泡液是在优势卵泡的发育过程中产生的，作为一种对卵泡发育和卵母细胞成熟起重要作用的培养基，其成分非常复杂，主要包括蛋白质、类固醇、多糖和代谢产物[9]。多项研究表明，卵泡液含有哺乳动物生殖过程中涉及卵泡生长和卵母细胞受精的基本物质[10]。已证实巨噬细胞炎症蛋白-3a、卵泡抑素、激活素和转化生长因子β（TGF-β）超家族成员对卵泡细胞的增殖和分化有应答作用[11-13]。卵泡液的成分可以作为卵泡细胞分泌活性和代谢情况的指标，在哺乳动物生殖过程中，卵泡液含有多种重要的生物蛋白，可以用于评估卵母细胞生长、成熟情况以及卵泡的质量[14]。卵泡液作为一种类似血浆的复杂体液的代表，含有各种不同浓度的蛋白质，能使我们更深入了解包括免疫因素在内与生育相关的蛋白质的组成情况[15]。因此，使用卵泡液作为鉴定RSA中蛋白质的样本，有助于发现RSA相关的诊断和预后标记物。

2006年，Kim等[16]首次采用基质辅助激光解吸及电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和纳米液相色谱-质谱联用（nano-LCMS/MS）对RSA患者的卵泡液进行蛋白质组学研究，结果鉴定出5种异常表达的蛋白：补体成分C3c链E、γ纤维蛋白原、抗凝血酶、血管紧张素原（AGT）和血凝酶前体，认为凝血因子（γ纤维蛋白原和抗凝血酶）在维持正常妊娠中发挥重要作用。此外，子宫内膜癌及卵巢功能低下患者卵泡液的蛋白也存在异常表达[17-18]。这些研究方法及结果为进一步寻找卵泡液中RSA的特异性蛋白标记提供了新的思路。

1.2 胎盘绒毛 胎盘是在母体和胎儿之间输送营养物质、交换气体和代谢产物的器官。近年来，研究人员发现RSA与胎盘细胞的凋亡过程密切相关，是B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）家族成员通过调控线粒体信号转导系统从而调控内源性凋亡途径引起的[19-20]。凋亡过程势必会发生凋亡相关蛋白的改变，因此分析胎盘绒毛的蛋白质组学改变，有助于我们发现与RSA相关的特异性蛋白标记。

2018年Pan等[21]利用iTRAQ技术和独创性途径分析（IPA）软件的生物信息学技术对4例正常妊娠和4例RSA患者胎盘绒毛组织的蛋白质组进行比较分析，发现有314种蛋白在胚胎发育过程中起着重要作用，其中AGT、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）和凝血酶原片段2（F2）是早期胚胎发育的核心因素。通过对这些胎盘绒毛中特异性蛋白的研究和分析，可以使我们更加深入地探索RSA的病因和发病机制。

1.3 血液 在临床实践中，与卵泡液和胎盘绒毛相比，血液更容易获得，患者也比较容易接受。因此血液更广泛地应用于RSA的诊断。最常用的血液样本是血浆和血清。血浆是指抽取的血液置入含抗凝剂的试管离心后获取的无细胞的上清液；而血清则是凝血完成后，纤维蛋白凝结并去除后得到的细胞外部分的上清液。在凝血的过程中，血清中的纤维蛋白被去除，因此与血浆中的蛋白含量有一定的差别。以往的研究表明，血浆应该是临床试验和蛋白质组学研究的首选来源[22]。

Kim等[23]研究收集了3例有RSA病史患者的血样和3例无流产史健康妇女的混合血样，采用2-DE和MALDI-TOF-MS技术发现了22种差异表达的蛋白，其中5种蛋白经过蛋白质印迹法（Western blotting）被证实，而间α胰蛋白酶抑制剂-重链4（ITI-H4）最具特殊意义，或可作为RSA的生物标志物。因此，血液蛋白质组学的研究对于探索RSA的发病机制和血液标志物也具有重要意义。

1.4 子宫内膜 随着蛋白质组学技术的发展，研究人员试图在更多的组织中寻找生物标志物。近年来，一些研究者采用蛋白质组学分析来探讨子宫内膜与RSA之间的关系。Weimar等[24]研究认为，人类子宫内膜基质细胞（ESCs）的迁移和侵袭能力与胚胎植入、滋养细胞和子宫内膜再生相关。因此，子宫内膜的异常变化与RSA的发病机制有一定的关系，对子宫内膜的研究仍然是RSA研究的重要组成部分。

体质量指数（BMI）的增加可增加流产风险。Metwally等[25]研究收集了16例RSA患者（12例为BMI≥25 kg/m2的肥胖患者、4例为BMI在19.5～24.9 kg/m2之间的患者）和5位正常育龄妇女（2例肥胖患者、3例为BMI正常者）的子宫内膜，利用2-DE分析得出肥胖RSA患者结合珠蛋白（Hpt）的表达水平明显高于BMI正常的RSA患者。上述研究为肥胖RSA妇女子宫内膜蛋白改变提供了初步证据，这种改变主要表现为与肥胖相关的炎症标志物——结合血红蛋白的增加。虽然对子宫内膜的蛋白质组学研究仍处于起步阶段，但也为寻找引起RSA的内膜因素给出了新的思路。

2 临床标本的选择

临床标本的选择应遵循易获得、损伤小、稳定性高的原则。虽然许多体液和组织都可以用于蛋白质组学分析，但样本的获取并不容易。在收集样本的过程中，除了要根据自身的研究需要选择不同特性的样本，还要严格控制采样的每一步骤，按照标准的操作流程对不同的标本进行处理。这样才能使科研结果更加准确和具有权威性，也有利于科研成果的借鉴和分享。

卵泡液的特点是其作为卵母细胞生长的微环境，对卵泡发育和卵母细胞的成熟都发挥着重要的作用。并且卵泡液的成分与血浆成分非常类似，可以直接反映颗粒细胞和膜细胞的新陈代谢活动以及卵泡渗透率的变化。但是，卵泡液通常需要在体外受精-胚胎移植（IVF-ET）时获取，所以相对于血液和尿液而言，标本的获取尤为困难，对操作的要求更加严格。客观来讲，并不适合成为广泛应用于临床疾病筛选的样本。

胎盘绒毛滋养层组织对维持正常妊娠起着重要作用，其生物学特性又与其表面蛋白质的变化有关。由此可知，通过对胎盘绒毛蛋白质组学的研究，对阐明着床过程和维持正常妊娠过程中一些未知而关键的问题有重要意义。但是，胎盘绒毛通常需要在患者行人工流产时获取，所以很难判断蛋白质的改变是发生在流产前还是流产后，势必会对结果的分析判断造成干扰，也不利于寻找预测流产发生的生物学标志物。

受精卵的着床及胚胎的发育均与子宫内膜的容受性密切相关，而子宫内膜的特异性蛋白表达又与其容受性有关。且子宫内膜容易获得，只要对取材的位置和时间做出统一的要求，掌握内膜周期性变化的规律，就可以将子宫内膜的蛋白质组学分析用于临床，筛选出流产相关蛋白，并将其作为预测流产的重要标志物。

血浆在生物标志物的研究中被广泛应用，因为几乎所有其他体液都直接或间接受到血浆的影响，血浆在体内直接接触邻近组织并与邻近组织的功能密切相关，从组织中分泌和转移的蛋白质在血浆中很容易获得。血浆的优点是其所含蛋白质的种类多且性质各异，作用重要，可以帮助我们认识疾病的演变过程。但血浆中97%的蛋白质是由以下7种主要的高丰度的血浆蛋白组成，分别是白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、转铁蛋白和脂蛋白。由于血浆中高丰度蛋白的含量高，因此对其进行蛋白质分离和鉴定的难度更大，定量检测要求更高，对实验结果的影响也更大。众所周知，低丰度蛋白才是与疾病密切相关的蛋白质，因此去除高丰度蛋白尤为重要。迄今为止，所有去除高丰度蛋白的方法都不可避免地导致与其结合的中、低丰度蛋白的丢失[26]。血浆作为样本进行蛋白质组学分析的另一个缺陷是血浆的性质不稳定，易受取材和储存方式的影响。由于个体的遗传背景、年龄、生活方式和药物使用等各不相同，循环血浆中蛋白质的浓度也会发生改变。尽管如此，由于所有的体液和组织都与血浆有关，说明血浆中的蛋白质变化可以反映出整个机体的功能变化。另外血浆的采集过程更为便捷，更加容易被患者接受，因此只要对血液样本的采集过程进行严格控制，从血浆中提取和筛选出的流产相关蛋白就有望成为临床早期预测流产的指标。

3 结语

综上所述，各种体液和组织都是潜在疾病生物标志物的重要来源，当一种疾病发生时，体液和组织中蛋白质表达谱的变化有助于了解疾病的机制。而血浆和子宫内膜作为各种体液和组织中最易获取的样本，具有早期发现RSA、监测疾病进展的潜在应用价值。因此，子宫内膜和血浆的蛋白质组学研究发现的特异性蛋白最有望成为临床早期诊断RSA的生物学标志物。然而，为了将蛋白质组学技术更好地应用于RSA发病机制的研究，寻找更加便捷可靠的诊断指标，还面临着诸多挑战与困惑。首先，尽管许多体液和组织都可以用于进行蛋白质组学分析，但实际获取相对困难；其次，虽然部分蛋白质的表达有差异，但是获取真正具有临床诊断价值的标志物仍然很艰难，需要长期大量的实验和探索；再次，由于取样方法和实验方法缺乏统一性，不同研究机构的数据之间无法进行有效的对比分析，数据重复性差，不能得到研究者的广泛认可；最后，由于该项技术应用成本非常高，让许多经费拮据的研究者望而却步。因此，我们要科学、客观地面对各样本的优势和劣势，依靠临床学科、基础学科、生物信息学和统计学等各学科研究者们共同的努力，开拓蛋白质组学技术在妇产科疾病中更广阔的应用前景。