CircRNA在女性生殖系统疾病中的研究进展

赵鸿娟，蒋元欣，王煜

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种闭合连续的环状非编码RNA，1976年首次在仙台病毒中发现[1]。CircRNA一度被认为是RNA错误剪接或剪接过程中产生的副产物，研究者认为其生物学功能不强，未对其有足够的重视和研究[2]。后来，随着高通量测序技术和生物信息技术的飞速发展，人们陆续在线虫、果蝇、小鼠、大鼠、猴子、树鼩和猪等动物身上也发现了circRNA的存在[3]。研究发现，circRNA具有组织特异性和高度稳定性等特点[4]，女性生殖系统疾病的发生、发展可能与circRNA的异常密切相关，circRNA可通过多种机制参与调控肿瘤细胞的增殖和侵袭，circRNA可能在作为肿瘤标志物和监测疾病预后中发挥至关重要的作用。

1 CircRNA的分子生物学研究

CircRNA是一类广泛而多样的内源性RNA，自发现以来，研究者又陆续在多种动植物体内发现并命名，人体内已发现大约2 400个circRNA分子。CircRNA通常由mRNA前体（pre-mRNA）反向剪接而成，长度从几百到几千bp不等。CircRNA按其来源可分为3类：外显子circRNA、内含子circRNA和外显子-内含子circRNA，其主要来源于外显子编码区。CircRNA的环状结构无极性也无多聚腺苷酸（Poly A）尾，与线性RNA相比不易被RNA核糖核酸酶水解，故circRNA具有较高稳定性。CircRNA受多种机制调控，其充当微小RNA（miRNA）海绵可竞争性结合miRNA受体，降低miRNA对靶基因的抑制作用，调节靶基因的表达水平[5]；circRNA可与mRNA部分碱基配对，直接调控mRNA，也可通过特异的RNA-RNA途径来调控转录；另外，circRNA可通过类似miRNA海绵的竞争性作用调节相关蛋白质的功能；circRNA还可参与翻译过程。Abe等[6]研究证明，哺乳动物或人类细胞中的circRNA可以不依赖任何核糖体进入位点、Poly A尾或帽子结构，以滚环式扩增，翻译出足量的蛋白产物。

2 CircRNA的作用

由于circRNA具有组织和发育阶段的特异性，越来越多的研究证实在子宫内膜、卵巢和宫颈细胞中存在特异circRNA的表达。近期Vo等[7]研究系统分析了人类肿瘤相关circRNA的表达特征，利用外显子捕获测序体系分析超过2 000例不同组织来源的人类肿瘤标本的circRNA表达谱，发现circRNA的表达量与所对应的线性RNA产物的表达量并不完全对应，并且肿瘤中circRNA的表达量普遍低于健康组织。CircRNA在女性生殖系统疾病的许多方面起着重要作用，包括调控细胞周期、细胞凋亡、血管形成及侵袭，circRNA的研究有助于临床对于这类疾病的诊断和预后，有望作为肿瘤标志物及疾病预后指标指导临床治疗。

2.1 子宫内膜异位症（endometriosis，EMs） EMs是指因内膜细胞种植到子宫腔以外的部位而导致的以痛经和不孕为表现的一种妇科疾病，其发病机制不明。迄今为止，人们普遍认为异位病灶是在月经期间子宫内膜碎片逆行产生的，但并不是所有经历经血逆行的女性均患有EMs，患者可能存在某些易感因素[8]。有证据表明，EMs在位内膜的基因表达水平与正常子宫内膜相比有明显改变[9-10]。Shen等[11]采用微阵列技术对4对卵巢巧克力囊肿和子宫在位内膜进行检测，并对24对样本进行逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测，发现262个上调的circRNA和291个下调的circRNA，它们与1225个miRNA相关元件结合。其中竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络包括122个miRNA和137个mRNA，并涉及9个信号转导通路，这些都可能与EMs的发病有关。Xu等[12]研究发现，与正常子宫内膜相比，异位子宫内膜中存在88个差异表达的circRNA，其中11个表达上调、77个表达下调，揭示了卵巢EMs中circRNA表达模式以及相关circRNA-miRNA-mRNA网络的作用，发现circRNA在卵巢EMs的发病过程中可能起着关键作用，进一步验证发现，表达上调的circ_0004712和circ_0002198可能成为诊断卵巢子宫内膜异位症的新型生物标记物。

2.2 宫颈癌（cervical cancer，CC） CC是最常见的妇科恶性肿瘤，持续高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是其发生和发展的重要因素。随着HPV疫苗的推广应用，宫颈癌的一级预防已在一定程度上得到实现，其发病率和死亡率在许多发达国家得到有效控制。然而，虽然女性中存在较高的HPV感染率，但CC的发病率相对较低，提示CC中存在个体遗传差异和其他重要影响因素。因此，探索CC的确切发病机制并找到全新的诊断标志物作为潜在的治疗靶点至关重要。1996年Braun等[13]在宫颈癌HeLa细胞中发现了通过外显子环化形成circRNA的剪接过程。circRNA-7可在HeLa细胞中稳定的过表达，miR-671通过间接调控circRNA-7的表达进而调控miR-7的活性，而miR-7的靶基因下调可有效促进HeLa细胞凋亡[14]。Ma等[15]研究发现，circRNA-000284在宫颈癌细胞中显著上调，促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭；构建干扰RNA，下调circRNA-000284，可使细胞周期G0/G1期阻滞，从而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭。另外，miR-506也与circRNA-000284相互作用，circRNA-000284可正向调控miR-506的靶基因snail-2的表达，miR-506模拟物或snail-2沉默载体的共表达可消除circRNA-000284的致癌效应，抑制宫颈癌细胞的增殖及迁徙能力，有助于抑制其转移，改善宫颈癌预后。hsa_circ_0023404可通过hsa_circ_0023404/miR-136/TFCP2/YAP轴影响宫颈癌的进展，并且其高表达可促进宫颈癌患者的病情进展[16]。Liu等[17]研究使用人circRNA微阵列筛选CC组织和配对的癌旁正常组织，结果显示CC组织中circRNA8924显著上调，并发现circRNA8924可通过竞争性结合miR-518d-5p/519-5p家族间接调节候选基因色素框同源蛋白8（CBX8）的表达进而促进子宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。Wang等[18]对3例HPV16感染诱发的宫颈癌和对应癌旁组织的全转录组进行分析，发现19种长链非编码RNA（lncRNA）、99种circRNA、28种miRNA和304种mRNA差异表达，每个miRNA都靶向多个lncRNA和circRNA。2019年Yi等[19]对人宫颈鳞癌及腺癌组织circRNA-miRNA-mRNA调控网络的研究发现，hsa_circRNA_000596、hsa_circRNA_104315、hsa_circRNA_400068、hsa_circRNA_101958和hsa_circRNA_103519可能作为ceRNA在宫颈癌中发挥重要作用。hsa_circRNA_101996在宫颈癌组织表达水平较正常组织高，且其表达水平与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移呈正相关，高水平的hsa_circRNA_101996与宫颈癌患者预后不良有关，circRNA_101996基因的下调显著抑制宫颈癌细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭，circRNA_101996通过抑制miR-8075的表达激活TPX2表达，增加宫颈癌的增殖和侵袭[20]。以上研究都为宫颈癌发病机制与治疗的研究提供了新思路。

2.3 卵巢恶性肿瘤 卵巢恶性肿瘤中以卵巢上皮性肿瘤最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤，其中卵巢上皮性肿瘤死亡率占各类妇科肿瘤的首位，由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占不足30%，大多数已扩散到盆腹腔器官。Ahmed等[21]通过对卵巢上皮癌ⅢC期原发灶、腹膜转移灶及淋巴结转移灶进行RNA测序发现，卵巢恶性肿瘤中可检测到上万种circRNA表达，癌灶组织中circRNA的表达水平明显高于腹膜转移灶和受累的淋巴结，通过原位病灶与转移瘤之间的比较，转移瘤中肿瘤相关信号通路分子如核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）和转化生长因子β（TGF-β）等所对应的mRNA上调而circRNA下调，说明circRNA的低表达可能与卵巢癌的转移有关。Bachmayr-Heyda等[22]研究发现，正常卵巢上皮细胞中circRNA水平普遍低于卵巢癌细胞，因为正常卵巢表皮细胞增殖速度快于卵巢癌细胞，导致其circRNA积累相对减少。Chen等[23]研究发现hsa_circ_0061140在卵巢癌细胞株中表达上调，敲除该基因后可通过海绵化miR-370抑制叉头盒转录因子M1（fork head box M1，FOXM1）的表达，抑制卵巢癌细胞在体内和体外的增殖和迁移。此外，多种包含miR-24/let-7结合位点的circRNA在转移瘤中呈上调趋势，提示circRNA可能通过其环化过程竞争性抑制mRNA线形剪接或miRNA海绵作用，调节肿瘤转移相关基因的表达，从而影响卵巢癌转移和侵袭[21]。

2.4 子宫内膜癌 子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，常见于围绝经期和绝经后女性。目前子宫内膜癌的病因和发病机制仍未明确。Bokhman[24]于1983年提出将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型并沿用至今。其中Ⅰ型为雌激素依赖型，多有子宫内膜增生和雌孕激素受体阳性；Ⅱ型为非雌激素依赖型，其发病与雌激素无明确关系。分子生物学研究认为，Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌均伴有不同的基因突变。Chen等[25]研究发现子宫内膜癌患者和正常女性之间circRNA有明显的差异性表达，在子宫内膜癌组织中circ-ZNF91可能作为miRNA海绵，抑制细胞中miRNA-23B和miRNA-122A2的表达。Xu等[26]对子宫内膜癌患者的血清进行研究，证实子宫内膜癌患者血清中外泌体浓度显著高于健康女性，并发现其中209个circRNA表达上调、66个表达下调；另外，通过对RNA序列进行分析发现，子宫内膜癌患者血清中hsa_circ_0109046和has_circ_0002577表达明显升高。

2.5 辅助生殖 辅助生殖过程中，胚胎移植是否成功与子宫内膜及胚胎植入密切相关。Liu等[27]利用芯片分析6例反复植入失败患者及正常妇女子宫内膜组织的circRNA表达谱，共筛选出856个差异表达的circRNA，为胚胎植入失败的诊断和临床治疗提供了新的候选因子。Zhang等[28]通过构建lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA网络探讨ceRNA在山羊子宫内膜容受性中的作用，发现circRNA-8073通过充当miRNA海绵来降低miR-181a的表达水平，间接增加了子宫内膜上皮细胞中神经紧张素的表达，神经紧张素通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路上调B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）/Bax表达，抑制子宫内膜上皮细胞凋亡，并诱导白血病抑制因子、环氧合酶2、血管内皮生长因子A等表达增加。因此，circRNA-8073可作为一种ceRNA发挥作用，抑制miR-181a表达，从而保护子宫内膜上皮细胞免受miR-181a介导的抑制作用。与胚胎植入前相比，早期妊娠小鼠子宫内膜中有101个上调的circRNA和75个下调的circRNA，构建circRNA-miRNA-mRNA负相关网络后，可下调21个circRNA和79个mRNA，上调14个miRNA[29]。

Tao等[30]检测了13 950个circRNA在山羊排卵前卵泡中的表达情况，分析显示麻城黑山羊与波尔山羊中有37个circRNA差异表达，circ-0008219参与了circRNA-miRNA-mRNA共表达网络，荧光素酶活性检测发现circ-0008219可通过miRNA海绵作用于3个卵泡相关的miRNA，提示circRNA在母羊卵泡中具有潜在作用，可能与卵巢卵泡发育有关。Wang等[31]对多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵泡液外泌体中16 771个候选circRNA进行高通量测序分析，相对于正常女性卵泡液，PCOS患者卵泡液中分别检测出167个上调circRNA和245个下调circRNA，对其进行功能分析，发现与细菌感染、慢性炎症和氧化应激相关的通路可被这些差异表达的circRNA靶向调节，并且通过构建circRNA-miRNA网络进一步验证了测序结果。此外，circRNA-103827对辅助生殖技术助孕后的妊娠结局有预测作用，表明其有着成为新的预测体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局的生物标志物的潜力[32]。

3 结语和展望

CircRNA作为新发现的RNA家族中的一员，由于其广泛性和稳定性正在成为新的研究热点，但是对于circRNA的研究还处于起步阶段。虽然已经发现并命名了很多种类的circRNA，但只有少数circRNA的生物学功能得以确定，大部分作用机制仍处于研究阶段。CircRNA表达与患者临床特征相关，参与细胞周期、细胞凋亡、血管形成及侵袭，并作为miRNA海绵参与细胞转移，提示circRNA可能参与肿瘤发生、发展过程，其在辅助生殖胚胎植入、卵泡发育等方面也发挥一定作用。CircRNA可以被分泌到细胞外环境中，临床可通过非侵入性手段在血液、尿液、组织及分泌物中检测出circRNA，这意味着将特定circRNA作为生物标志物及疾病预后指标成为可能。研究人员可以对已知功能的circRNA进行更加细致深入的研究，同时通过发现各类circRNA的分子作用机制，为疾病的临床诊断、治疗及预后预测提供新的依据和方向。