TLR4/NF-κB信号通路、自噬与炎性痛的关系*

孙亚兰，黄 诚

(赣南医学院 1.2018级硕士研究生；2.基础医学院；3.疼痛医学研究所，江西 赣州 341000)

疼痛是一种与现在或潜在的组织损伤相关联的不愉快的主观感觉与情感体验[1]。慢性痛普遍且持续存在于多种疾病的发病过程，由于其发病机制的复杂性和治疗的局限性，至今仍然困扰着无数患者。目前，临床上最常见的慢性痛主要有炎性痛、神经病理性痛和癌性痛。炎性痛是由创伤、感染、化学刺激或外科手术操作等所诱发的疼痛[2]。TLR4/NF-κB信号通路激活后所产生的炎性介质可导致炎症反应，而与炎症相关的变化则可诱导神经纤维周围化学环境的敏化、受损细胞内源性因子的释放，并可激活神经纤维和邻近的非神经细胞(如星形胶质细胞、小胶质细胞、血小板和免疫细胞)[3]。自噬通过与TLR信号通路的相互作用来调节炎症反应，影响巨噬细胞、嗜中性粒细胞等炎症细胞的发育、平衡和存活以及诸多细胞因子的转录和分泌[4-5]。本文主要围绕TLR4/NF-κB信号通路的组成、活化、生物学效应及其在炎性痛的调控下与自噬相关分子的关系综述如下。

1 TLR4/NF-κB信号通路

1.1TLR4分子TLRs是一类跨膜模式识别受体，通过识别外源性配体、病原相关分子模式和危险相关分子模式来介导先天性免疫和适应性免疫[6]。自从1997年TLR4在哺乳动物体内被发现以来，目前已发现10种人类功能性TLR(TLR1-TLR10)和12种小鼠功能性TLR(TLR1-TLR9和TLR11-TLR13)。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于质膜中以识别细菌膜成分，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要位于细胞内隔间以识别核酸配体[7]。TLR4是第一个与果蝇Toll蛋白同源而被发现的TLR，它属于I型跨膜受体蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，胞外区富含亮氨酸的重复序列，胞外域结构弯曲成马蹄状，其富含亮氨酸的重复序列部分构成配体结合区，并识别各种病原相关分子，跨膜区富含半胱氨酸结构域，胞内区与人的白介素1受体高度同源。

1.2NF-κB分子核因子κB(NF-κB)是调节核转录的转录因子，其家族成员包括NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)、RelA(P65)、RelB和c-Rel等[8]。IκBα、IκBβ、IκBε和P50、P52的前体为NF-κB的抑制蛋白。细胞静止时，NF-κB在胞浆中可抑制蛋白的结合，但不影响转录。一旦细胞激活后，IκB的氨基末端高度保守的丝氨酸残基被IκB激酶(IKK)催化后发生磷酸化，进而被降解。IKK是NF-κBs上游的调节因子，以与抑制性IκBs结合的同二聚体或异二聚体的形式存在[6]。IκB降解后的NF-κB分子二聚体进入细胞核，与DNA结合来调节基因的转录。

1.3TLR4/NF-κB信号通路的激活NF-κB是TLR4信号通路下游的关键转录因子，在调节免疫应答中起重要作用[9]。根据是否需要MyD88的介导，可将TLRs信号通路分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性，而TLR4兼有以上两条信号通路的功能。MyD88分子的C-端含TIR结构域，与TLR4胞内区的TIR结合，N-端通过死亡结构域(DD)募集下游含有DD结构域的信号接头分子，使下传信号激活NF-κB并诱导促炎细胞因子的分泌。TRIF的N-端可激活NF-κB，从而诱导促炎细胞因子的释放。NF-κB信号通路的激活和促炎细胞因子的表达与多种类型细胞TLR4的激活有关[10]。TLR4能识别各种外源性病原体相关分子或毒素，并与相应配体发生相互作用， NF-κB激活后可分泌促炎细胞因子，从而启动获得性免疫反应[11]。综上可见，TLR4在细胞炎症反应中发挥重要作用。

2 TLR4/NF-κB信号通路与炎性痛

越来越多的研究表明，TLR4是促炎反应中的关键受体之一，它与持续性疼痛的病理机制有关[12-13]。TLR4的活化最终表现在mRNA和蛋白水平上激活NF-κB，而NF-κB信号通路的激活主要可诱导促炎细胞因子的释放。在暴露于微囊藻毒素的亮氨酸精氨酸(Microcystin-leucine arginine, MC-LR)后的48 h内，激活的TLR4和NF-κB可上调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表达[14]，而这些促炎细胞因子和活性氧反过来又可使痛觉感受器敏化，从而导致炎性痛的发生[15]。TLR4不仅在免疫系统有表达，而且在神经系统的神经元和非神经元(如小胶质细胞、星形胶质细胞)中也有表达。有研究[16]显示，miR-451可能通过TLR4靶向抑制激活的小胶质细胞所诱发的炎症反应，减轻完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant, CFA)诱导的炎性痛[17]。蒿本内酯经静脉注射后可抑制脊髓星形胶质细胞的TLR4表达，进而减轻CFA或脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的慢性炎性痛的发生发展。在脊髓缺血再灌注(Ischemia reperfusion, IR)所诱导的炎性痛中，CXCL12/CXCR4通过激活星形胶质细胞和小胶质细胞的TLR4正反馈环，在炎性痛的发生和维持中发挥重要作用。若下调CXCL12/CXCR4的表达，可抑制脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的TLR4激活，并有效改善痛敏行为和减少促炎细胞因子的释放[18]。以上实验证据表明，TLR4在炎性痛的发生发展过程中扮演着重要角色。

3 自 噬

自噬是细胞利用溶酶体来降解自身受损的细胞器和大分子的过程，是细胞存活、分化和发育的重要机制[19]。根据细胞内底物运送到溶酶体内方式的不同，可分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。在自噬形成的初始阶段，多种ATG蛋白在诸多信号通路的调节下被募集到PAS上，它们相互协调并参与自噬小体的形成。其中核心复合物主要是在自噬初始阶段起作用的ULK复合物。此外，在自噬小体中发挥作用的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)复合体Ⅰ以及两类泛素化结合的复合物，它们对自噬小体双层膜的形成也至关重要[20]。

3.1TLR4/NF-κB信号通路对自噬的调控自噬是炎症产生的一个重要途径[21]。TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAFs)蛋白家族中的一员，其泛素连接酶活性在细胞自噬的启动和功能中起着关键作用，并参与调节TLR所介导的信号传导[22]。在TLR刺激下，MyD88募集白细胞介素-1受体相关激酶1(IRAK-1)和白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK-4)[23]，而磷酸化的IRAK-1可募集TRAF6、E3泛素连接酶和支架蛋白。然后TRAF6通过Lys63(K63)连接的泛素链进行自动泛素化[24]，泛素化的TRAF6可激活一个包含丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7/TAK1)、TGFβ活化激酶1(MAP3K7)结合蛋白1(TAB1)和TGFβ活化激酶1(MAP3K7)结合蛋白2(TAB2)的复合体[25]，随后该复合体诱导IKK复合物的磷酸化，导致NF-κB和促炎细胞因子的表达升高[23]。有研究表明TLR4可诱导自噬，它的参与可募集MyD88和Beclin1[26]。Beclin1是哺乳动物酵母ATG6的同源物，是Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶复合物(PI3KC3)的关键成分，其与多个协同因子参与自噬调节。MyD88和TRIF过表达均可导致Beclin1的募集，TLR4将Beclin1募集至受体复合物中，TRAF6可直接导致Beclin1泛素化，而Beclin1泛素化增强了PI3KC3的活性，使TLR信号诱导的NF-κB和A20激活，致使Beclin1泛素化减少，从而降低巨噬细胞的自噬。在炎症反应中，Beclin1-K63的泛素化对自噬调节起着重要作用[27]。有研究发现在VB2细胞培养中，LPS可抑制小胶质细胞的自噬[28]。LPS刺激原发性单核细胞可导致Beclin1和K63的连锁泛素化[27]。进一步的实验显示，通过TLR4下游信号分子MyD88/TRIF-NF-κB的信号级联反应，TAK-242(TLR4的抑制剂)可抑制神经元自噬和神经炎症反应[29]。以上结果提示TLR4/NF-κB信号通路在自噬调节中发挥着重要作用。

3.2炎性痛与自噬炎性痛通常发生在组织损伤和免疫细胞浸润的部位[30]。炎症小体是一种由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1组成的胞质多蛋白复合物，在病原体入侵后可诱导促炎细胞因子的生成。虽然NLRP3炎症小体的正常激活有助于宿主防御，但过度激活可导致炎症性相关的疾病。在SD大鼠足底注射CFA后，皮肤组织中的ASC、NLRP3炎症小体、Caspase-1、IL-1β、Caspase-1 p20和IL-1β p17的表达显著增加[31]；此外，IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的表达也明显上升[32]，这些炎性介质可诱导痛觉过敏。炎症小体的异常激活促使大量炎性因子的释放，进一步导致严重的组织损伤和炎症性疾病的发展。因此，NLRP3炎症小体的激活需受到严格的调控。自噬是一种细胞内降解系统，当机体暴露于微生物感染、微粒物质和ATP时，可清除受损细胞器，自噬限制了NLRP3炎症小体的激活[33]。比如，NLRP3炎症小体的激活物可引起线粒体损伤，进而导致ROS的产生，引发NLRP3炎症小体的激活。自噬还可诱导受损吞噬体的清除，泛素化的ASC和IL-1β可抑制由其他炎症小体介导的IL-1β产生[34]。IL-1β、IL-1α和IFN-γ可诱导Beclin1的泛素化，这表明也可以通过类似于LPS的机制来激活自噬[35]。在小鼠外周血单核细胞中，应用3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)抑制自噬，可导致IL-1β释放的增加和TNF/TNFα的降低[36]。在腰椎间盘神经根疼痛时，可致使microRNA-21异常升高和IL-6的表达增加，但是细胞的自噬减少[37]。这些实验结果表明炎性痛与自噬之间存在着交互作用。

4 小结与展望

综上所述，在炎性痛的发生发展过程中，TLR4/NF-κB信号通路起着至关重要的作用。自噬为炎症小体的主要调节器，而且TLR4/NF-κB信号通路在自噬中也发挥着重要的调节作用。因此，在炎性痛中，TLR4/NF-κB信号通路、炎症小体与自噬相关分子之间存在相互联系，目前，有关TLR4/NF-κB信号通路与炎症小体、自噬相关分子的研究还不多，对于TLR4/NF-κB信号通路与炎症小体、自噬相关分子之间的关系有赖于进一步实验来加以揭示。自噬可清除与损伤相关的分子模式、炎性成分或细胞因子，进而减少炎症小体的激活。同样，炎症小体可以调节自噬过程，因此，阐明它们的相互作用可能是临床治疗炎性痛的关键所在。

TLR4/NF-κB是经典的炎症信号通路，对炎性痛的发生发展具有调节作用，愈来愈多的研究表明，通过抑制TLR4/NF-κB信号通路可降低炎性介质的释放，从而缓解疼痛，这为治疗炎性痛提供研究思路。近年来，随着中医药理论和实践的快速发展，对中药有效成分和功效的研究备受关注。三氟淫羊藿素(Rifluoro-icaritin, ICTF)是小檗科淫羊藿属植物干燥茎叶提取物淫羊藿素(Icaritin, ICT)的衍生物。有研究显示ICT在人先天免疫细胞中具有抗炎作用，它能抑制CD14/TLR4对脂多糖的识别，以及抑制NF-κB信号通路[38]。此外，ICT能激活转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)改善氧化应激并降低血管内皮生长因子和炎症细胞因子[39]。ICTF可通过抑制氧化应激对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[40]。为此，基于炎性痛的发病机制和ICT的抗炎作用，通过进一步探索ICTF是否通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的抗炎作用机制，为临床治疗炎性痛提供新靶点和途径。