肠道菌群在宿主抗柠檬酸杆菌感染中的作用和机制*

谢 园，陈玲霞，刘雨霞，谢 璐，吴雄健，刘志平,,*

(赣南医学院 1.2017级硕士研究生；2.基础医学院；3.炎症与免疫中心；4.第一附属医院消化内科，江西 赣州 341000)

鼠类柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)是一种革兰氏阴性细菌，可感染小鼠的远端结肠，引起结肠隐窝增生，长期以来用于研究临床上重要的肠道致病性大肠杆菌(EnterophogenicEscherichiacoli, EPEC) 和出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicE.coli, EHEC) 感染的发病机制[1]。而且C.rodentium感染引发的粘膜炎症与炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases, IBD)的症状相似，可以作为慢性肠道炎症性疾病模型，用于研究宿主基因和肠道菌群与肠道炎症的关系。

C.rodentium利用Ⅲ型分泌系统(Type 3 secretion system, T3SS)诱导小鼠结肠隐窝增生，促进结肠粘膜细胞的增殖，也导致小鼠肠道出现明显的生态失调，表现为C.rodentium的过度生长、宿主肠道菌群的丰度和整体多样性的减少。C.rodentium诱导的结肠炎受到宿主遗传背景的影响：近交系C3H/HeJ、C3H/HeOuJ和FVB小鼠在感染后显示出高死亡率，而 C57BL/6小鼠只产生自限性结肠炎[2-5]。有趣的是，在C.rodentium感染前，通过肠道菌群移植，将抗性小鼠的菌群转移到易感小鼠，导致易感宿主对C.rodentium抗性的增加[6]。C.rodentium介导宿主肠道菌群产生信号分子以此导致感染并诱发疾病，这说明健康的肠道营养和肠道菌群对诸如C.rodentium等细菌感染的易感性和疾病进展非常重要[7]。本文就肠道菌群与宿主对C.rodentium感染的易感性的研究进展作一综述。

1 肠道菌群与C. rodentium易感性

肠道菌群主要包括三类：(1)共生菌，属于肠道的优势菌群，包括乳酸杆菌(Lactobacillus)、分节丝状菌(Segmentedfilamentousbacterium, SFB)等专性厌氧菌，具有免疫调节的作用；(2)条件致病菌，为非优势菌群，包括肠杆菌、肠球菌等，肠道紊乱或位置改变时对人致病；(3)致病菌，一般为过路菌，数量少， 超过正常才致病[8]。当出现正常细菌与致病菌的比例失调时，机体容易出现感染或炎症。影响肠道菌群的因素有很多，其中环境因素，尤其是饮食，是影响肠道菌群结构的主要因素。

饮食中ω-6多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid, PUFA) 和ω-3 PUFA含量会影响溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)的风险。在C.rodentium感染诱导的结肠炎期间，ω-6 PUFA喂养的小鼠有更多的肠道损伤、免疫细胞浸润和C.rodentium穿过肠粘膜的易位，且小鼠肠道中诱发炎症的菌群丰度增高。而在ω-6 PUFA饮食中添加ω-3 PUFA后，诱发炎症的菌群数量降低、有益菌的丰度增高、免疫细胞浸润减少以及感染期间细胞因子/趋化因子诱导减少。通过改变PUFA组成而改变肠道菌群的丰度，导致宿主对C.rodentium诱导结肠炎的易感性的改变[9]。此外，饮食中的铁元素对儿童的健康发育有着重要影响，但是机体对铁的低吸收通常会导致>80%的铁进入结肠。而铁对于许多致病性肠杆菌的生长和致病力至关重要。研究表明向断奶的婴儿提供含铁的营养素粉会增加其肠道病原菌的丰度并引起肠道炎症[10]。给小鼠投喂缺铁、正常铁或高铁的日粮，2周后用C.rodentium感染，肠道菌群测序分析显示，与正常铁和高铁饮食组小鼠相比，缺铁饮食的小鼠感染后肠道中益生菌如Lactobacillus和双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度更高，炎症因子水平更低、有较轻的结肠病理损伤以及感染后体重恢复更快[11]。

除了饮食，心理压力也是引起肠道菌群失调的一个重要因素。有研究发现， 小鼠感染C.rodentium之前，长期接触应激原会改变其肠道菌群的结构，如短链脂肪酸(Short-chain fatty acid, SCFA)和Lactobacillus的减少，这将加重C.rodentium诱导小鼠的结肠炎，增加组织病变和炎症介质的产生以及细菌从结肠到脾脏的易位[12-14]。另外有研究发现，加入Lactobacillus则可以显著减少C.rodentium从结肠到脾脏的易位[15]。

总之，饮食和心理压力都有可能引起肠道菌群结构的变化，如改变有益菌和有害菌的比例，从而导致宿主对C.rodentium易感性的变化。下文就几种主要菌群在抗C.rodentium感染中的作用展开叙述。

2 与宿主抗C. rodentium感染相关的肠道共生菌

2.1LactobacillusLactobacillus是益生菌的重要一员，能通过吸附防御、促进修复、调节免疫、促进营养吸收等维护机体健康，临床应用于抗病原体感染等治疗。有研究通过注射选择性富集的Lactobacillus，抑制了γ变形菌(γproteobacteria)和放线菌(Actinomycetes)的扩增，提高了粘膜屏障功能，减少了传染性结肠隐窝增生和组织炎症因子的产生，增强了小鼠对C.rodentium感染的抗性[16]。向小鼠饮食添加含有Lactobacillus和Bifidobacterium的发酵乳制品(Fermented dairy products, FDP)，使得小鼠肠道菌群多样性增加，降低了小鼠对C.rodentium感染的易感性。虽然FDP不影响C.rodentium的定植与黏附和擦拭性损伤(Attaching and effacing lesions, A/E)的形成，但其减少了与病理损伤相关的细菌增殖，从而减轻了C.rodentium诱导的结肠炎[17]。

进一步研究发现单一喂养LactobacillusbrevisKB290也会降低小鼠对C.rodentium的感染的易感性[18]。另外有研究利用鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)对C57BL/6小鼠进行预处理可改善C.rodentium诱导的结肠炎[19]。嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)可以减轻小鼠感染C.rodentium后的腹泻表型[20]，并且在早期用L.acidophilus预接种可以增强宿主对C.rodentium感染的防御并减弱结肠炎[21-22]。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)可以预防应激原暴露对C.rodentium诱导的结肠炎的恶化作用[23]；LGG、L.acidophilus和LactobacillusplantarumA的组合菌赋予宿主对C.rodentium所引起的结肠炎的保护作用[24]。 用瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和LGG混合菌预先给药和共同给药也均能改善C.rodentium诱导造成的小鼠肠道屏障功能障碍和上皮增生等症状[21,25]；L.rhamnosus和L.acidophilus的组合菌预处理减弱C.rodentium诱导的小鼠结肠炎症[26]；干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)刺激机体粘膜免疫，减少小鼠感染后的C.rodentium的载菌量[27]。肠道中Lactobacillus能通过H2O2抑制C.rodentium毒力相关LEE致病岛的表达从而减弱毒力，增强小鼠对C.rodentium感染的抗性[28]。

由此可见，有益菌Lactobacillus，无论是单一使用还是联合使用多种菌Lactobacillus，都可以减轻C.rodentium感染造成的肠道炎症，疗效比较明显。但是，Lactobacillus提高宿主抵抗C.rodentium感染的具体机制目前尚无定论，有待进一步研究。

2.2SFBSFB是定植于回肠末端且紧密黏附于肠上皮细胞的一种厌氧型肠道共生菌[29]。SFB与宿主免疫系统密切相关，如增强Th17细胞的分化、刺激机体内sIgA的分泌(sIgA和Th17是肠道粘膜免疫的重要功能分子)，从而能帮助宿主抵抗外源致病菌的感染[30-32]。宿主对C.rodentium的免疫清除依赖于IL-22、IL-23和抗菌肽RegⅢγ[33-35]。单一定植 SFB 后，肠腔sIgA的分泌和Th17细胞的分化明显增强，IL-17和IL-22的产生增加。另外，SFB的定植能诱导血清淀粉样蛋白 A(Serum amyloid A, SAA)的产生，而SAA能促进中性粒细胞和单核细胞产生IL-1β、IL-8、TNF-α、IL-23和IL-12[36-37]。小鼠定植SFB能够增强宿主对C.rodentium感染的抗性，而小鼠的共笼实验再次确认，SFB的转移确实可以使接受SFB的受体抑制C.rodentium的生长，改善了结肠炎的症状，如减轻肠上皮细胞增生和结肠缩短[32]。IL-21R-/-小鼠由于免疫功能缺陷比野生型(Wild-type，WT)小鼠对C.rodentium诱导的结肠炎更易感。对IL-21R-/-小鼠移植SFB后，发现小鼠感染C.rodentium造成的炎症症状及相关组织病理学特征减轻，再次确认SFB的定植能够增强宿主抵抗C.rodentium的感染[38]。

SFB的定植能帮助正常小鼠或IL-21R-/-小鼠抵抗C.rodentium的感染，但在络氨酸激酶Lyn基因敲除(Lyn-/-)小鼠和膳食中缺乏维生素D3(Vitamin D3,VD3)的小鼠，肠道中SFB丰度的升高并不能减轻C.rodentium感染导致的结肠炎。Lyn-/-小鼠中SFB扩增尤为突出，IFN-γ+/IL-17+T细胞数目增加，但是与WT小鼠相比，Lyn-/-小鼠无法抑制C.rodentium的感染，其感染后结肠病理症状加重[39]。这与前述SFB菌定植能抑制C.rodentium感染的结果相反，分析原因可能与 IFN-γ+/IL-17+T 细胞的过度增加具有致病性有关[40]。和正常小鼠相比，VD3缺乏小鼠肠道中SFB丰度也更高，但是其在C.rodentium感染后，小鼠体重明显减轻，肠道细菌载量更高，并且肠道组织的炎症细胞浸润增加以及炎症介质水平显著提高，组织损伤严重[41]。随后的研究发现，VD3缺乏小鼠中3型先天性淋巴细胞(Group 3 innate lymphoid cells,IL3)的发育和功能缺乏，因此对C.rodentium感染更易感，而SFB的增高并不能逆转宿主易感性[42-43]。

总之，大部分研究支持SFB增加可以增强宿主对C.rodentium感染的抗性，主要是通过促进Th17细胞分化及相关细胞因子的分泌。但是，在一些情况下，如Lyn缺陷或者缺乏VD3, SFB的增加不能增强或者甚至减弱宿主对细菌感染的抗性，因此SFB影响机体对抗肠道细菌感染的机制仍需更深入的研究。

2.3毛螺菌科 (Lachnospiraceae)Lachnospiraceae属于厌氧的有益菌，该家族的成员与肥胖、人类结肠癌的保护有关，主要是由于它与SCFA的产生有关[44]。肠道微生物发酵膳食纤维产生的SCFA，如乙酸、丁酸和丙酸，与肠道微生物相互调节和相互影响，可以降低肠道炎症反应、提高粘膜屏障功能，在维持机体稳态及正常生理代谢中发挥着重要作用[45]。向C.rodentium感染的小鼠给予丁酸后，病原体清除所需的基因(IL-17a和IL-1β)和参与肠上皮屏障修复的基因(Relmβ、Tff3和Myd88)表达升高，结肠炎的症状减轻。丁酸的直肠给药增加了结肠炎小鼠肠道中Lachnospiraceae和Proteobacteria的丰度，通过增强免疫调节和组织修复能力改善了增强了宿主对C.rodentium感染的抗性[46]。小鼠切除盲肠使得产生SCFA的菌群，包括Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度降低，并且在C.rodentium感染后期表现出更低的体重，提示 SCFA 菌群丰度的下降可能减弱小鼠在C.rodentium感染后期的恢复能力[47]。

总之，以上研究提示Lachnospiraceae可能通过产生丁酸等SCFA来增强宿主对C.rodentium感染的抗性，但专一定植Lachnospiraceae来研究宿主对C.rodentium易感性的影响暂未见报道。

2.4嗜粘蛋白-艾克曼菌(Akkermansiamuciniphila)A.muciniphila是一种能产生多种酶将粘蛋白降解的细菌[48]。其定植于粘蛋白含量最高的粘液层，而粘液层是肠道上皮细胞屏障的重要部位。研究表明，A.muciniphila的丰度与肥胖、炎症、肿瘤和Ⅱ型糖尿病等疾病呈负相关，在这些疾病中具有保护作用[49-51]。

研究显示，长期或间歇性膳食纤维缺乏会增加A.muciniphila、Bacteroidescaccae等粘液降解细菌的丰度，且在此期间，肠道菌群会利用宿主分泌的粘液糖蛋白作为营养源，从而导致结肠粘液屏障的侵蚀、破坏。最终增加宿主对C.rodentium感染的易感性[52]。另外一项研究显示使用Notch信号通路抑制剂会增加肠道A.muciniphila的丰度，并且增加宿主对C.rodentium的感染的易感性[53]。这提示，A.muciniphila丰度增加可能减弱宿主抗C.rodentium感染的能力。

总之，虽然有研究表明A.muciniphila膜上的耐高温蛋白Amuc_1100能改善肠道的屏障功能[54]，但A.muciniphila整体是否改善肠道屏障还不清楚。当前研究也主要支持A.muciniphila可能通过增加对肠道黏液层的降解而使宿主对C.rodentium的感染的易感性增加。此外，单一定植A.muciniphila对肠道抗C.rodentium感染的作用还未见报导，所以A.muciniphila在宿主抗C.rodentium感染中的确切作用尚不清楚。二者之间的关系及其具体机制都需要更加深入的研究。

3 结 语

我们总结了肠道菌群中Lactobacillus、SFB、Lachnospiraceae和A.muciniphila通过不同的方式改变宿主对C.rodentium感染的抗性。总的来看，在大部分研究中，Lactobacillus、SFB、Lachnospiraceae可以增强宿主对C.rodentium感染的抗性，是益生菌，而A.muciniphila则减弱宿主对C.rodentium感染的抗性，对于此病原菌感染是有害菌。

从机制看，目前对Lactobacillus在C.rodentium感染中的可能作用机制还不清楚，可能与增强肠道细胞因子的表达有关。SFB可能通过增强Th17细胞分化及相关细胞因子如IL-17和IL-22的分泌, 促进杀菌而增加宿主对C.rodentium感染的抗性。Lachnospiraceae则可能通过促进SCFA的产生来增强宿主对C.rodentium感染的抗性。A.muciniphila虽然在肿瘤和代谢性疾病中可能有保护作用[49-51]，但是目前研究支持其减弱宿主对C.rodentium感染的抗性，其作用机制可能与降解肠道粘液层，破坏肠道上皮屏障有关。但是，总的来说，这些共生菌在肠道细菌感染中的具体作用机制都还不是很清楚，值得进一步的研究。特别是对于Lachnospiraceae和A.muciniphila的研究中，直接定植这两种细菌，研究其对C.rodentium感染的易感性的影响还未见报道，其确切作用还不够清楚。

综上所述，肠道菌群结构的改变可以抑制或促进C.rodentium感染导致的炎症反应，调节肠道菌群对于预防和治疗细菌导致的肠道炎症性疾病有着重要的意义。肠道菌群在临床治疗中的作用也日益受到重视，如益生菌、粪菌移植，都可能增加有利于健康的肠道菌群，增强机体对病原菌感染的抗性[55]。

目前，临床上益生菌使用广泛，但主要集中在Lactobacillus和Bifidobacterium等疗效较明确的细菌[56-58]。且临床上现有的益生菌对保存条件以及患者肠道胃酸水平都有严格要求，并对不同人群是有不同的治疗效果[57]。研究开发更多的益生菌或其代谢产物(如 SFB、Lachnospiraceae以及SCFA等)用于临床抗感染的治疗非常有意义。