基于网络药理学的含水蛭经方抗肿瘤机制研究▲

曾 洁 麦荣云 阮景晟 鞠佳霓 王宗玉 陈 闯

(广西医科大学附属肿瘤医院中医科，南宁市 530021，电子邮箱：zengjiehcc@163.com)

中医药是中华民族的瑰宝，中药复方是中医临床的主要形式，其机制尚未十分明确，是目前的研究热点之一。针对药效物质的探索，目前已形成了不同模式的研究方法，例如基于协同作用研究中药药效物质基础，利用软件分析中药指纹图谱与药效指标的相关性(谱效关系)，或在方剂配伍理论指导下选择方剂中活性相同但机制不同的成分进行配伍，研究其协同作用[1]，但均尚未取得突破性进展。网络药理学是信息科学、医学生命科学等多学科交叉的新学科方向[2]，可应用于阐释中药方剂主成分及配伍关系、筛选中药活性成分、分析中药药效作用机制等多方面[3-4]。研究发挥某类功效的中成药组方规律，不但可以探索组方用药之间的关联规则，而且可能发现潜在的药物组合，有助于开发新药以及加深理解其药理作用[5]。此外，对复方中起效的单体、作用靶点、信号通路等进行预测及关联[6]，也有助于理解药效作用机制。

含有水蛭的经方主要作用是活血化瘀，故这类方剂有共同的机制，又有各自特点，其用于治疗肿瘤有较悠久历史。本文利用网络药理学的方法对含有水蛭的抗肿瘤经方的组方规律、核心配伍中药以及水蛭的起效单体、作用靶点、信号通路等方面进行研究，为研究含水蛭的经方抗肿瘤机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 水蛭相关方剂的收集 TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)是整合了47 000个方剂、8 159味中药以及它们包含的25 210个主要成分信息的数据库[7]。从TCMID中下载数据，使用Excel筛选整理水蛭相关的方剂的方剂名称、方剂组成、用药方式所治疾病及出处，选取具有抗肿瘤作用的水蛭相关的方剂。

1.2 水蛭抗肿瘤经方组方配伍网络的绘制 将水蛭抗肿瘤方剂的药物配伍信息，用Excel建立文本库，导入Cytoscape 3.5.1软件，绘制中草药配伍的网络图，利用Degree算法筛选出现频率前10位中草药作为水蛭抗肿瘤经方的核心中草药。

1.3 配伍中草药的化学成分分析及潜在靶蛋白的预测 通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[8]收集水蛭抗肿瘤经方的核心中草药及其化学成分，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%、类药性(druglikeness，DL)>0.18作为截断值，筛选符合条件的化合物进行靶蛋白预测，利用Cytoscape 3.5.1软件构建配伍中草药的成分-靶点网络，并利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制配伍中草药靶蛋白的重复情况。

1.4 配伍中草药靶蛋白的蛋白-蛋白互作网络图及通路富集分析 利用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)直接对配伍中草药靶蛋白构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络图，并直接利用KOBAS 3.0数据库(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)[9]对靶蛋白进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集。通过Cytoscape 3.5.1软件中的MCODE插件分析配伍中草药靶蛋白PPI网络，提取核心子集，再利用KOBAS 3.0数据库对该子集蛋白进行KEGG通路富集分析。

1.5 水蛭素的靶蛋白预测及其PPI网络图、通路富集分析 水蛭素是水蛭发挥功效的主要成分[10]，在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中收集到其化合物结构共21种，利用CTD数据库(http://ctdbase.org/)[11]预测水蛭素的靶蛋白。利用STRING数据库构建靶蛋白的PPI网络图，使用KOBAS 3.0数据库进行KEGG通路富集分析。

2 结 果

2.1 水蛭相关方剂出处与主要治疗方向 基于TCMID数据库，筛选出含有水蛭的口服方剂共106个，分别来自《圣惠》《普济方》《千金》《圣济总录》等39部典籍，见图1。水蛭相关的106个方剂分别应用于痛症(27/106)、产后病(21/106)、闭经(19/106)、外伤疼痛(17/106)、月经不调(16/106)、腹腔肿瘤(10/106)、骨折(10/106)、麻风(3/106)、淋巴结核(2/106)、阴道出血(2/106)、疝气(2/106)、心绞痛(1/106)、肝硬化(1/106)和疮疡脓肿(1/106)14种疾病。

图1 水蛭相关方剂的出处

2.2 水蛭抗肿瘤经方的组方配伍网络 水蛭抗肿瘤方剂共10个，分别是摩挲丸、琥珀丸、桃仁丸、芫花散、通经散、加味抵当丸、水蛭饮、化蛊丸、大黄(庶虫)虫丸、愈黄丹。共涉及41味中草药，根据经方里中草药的配伍情况构建网络图(图2)，节点之间连线代表中草药之间存在配伍关系。对药物使用频率前10位的中草药依次为水蛭、虻虫、大黄、桃仁、干漆、琥珀、牛膝、三棱、莪术、肉桂，其中水蛭、虻虫、大黄、桃仁、干漆、琥珀、三棱、莪术均为活血化瘀药。

图2 水蛭抗肿瘤经方的中草药配伍网络

2.3 配伍中草药的分子-靶点相互作用网络及其靶点的PPI网络图 TCMSP数据库收录有水蛭抗肿瘤经方中的大黄、桃仁、三棱、莪术。以OB>30%且DL>0.18为筛选标准，与大黄有关的92个化合物中有16个符合标准，分别是大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-1-O-β-D-glucopyranoside)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷[torachrysone-8-O-beta-D-(6′-oxayl)-glucoside]、胡萝卜苷qt(Daucosterol_qt)、没食子酸-3-O-(6′-O-镓基)-葡萄糖苷[gallic acid-3-O-(6′-O-galloyl)-glucoside]、棕榈苷A(palmidin A)、大黄素甲醚双葡萄糖苷(physcion diglucoside)、β胡萝卜素氧化物(mutatochrome)、番泻苷D_qt(sennoside D_qt)、番泻苷E_qt(Sennoside E_qt)、泽兰黄醇素(eupatin)、原花青素B-5，3′-O-没食子酸酯(procyanidin B-5，3′-O-gallate)、大黄酸(rhein)、(-)-儿茶素[(-)-catechin]、芦荟大黄素(aloe-emodin)、决明内酯(toralactone)。与桃仁有关的66个化合物中有23个符合标准，分别是谷甾醇α1(sitosterol alpha1)、2，3-二脱水GA 70(2，3-didehydro GA70)、2，3-二脱水GA77(2，3-didehydro GA77)、GA119、GA120、GA121-异形内酯(GA121-isolactone)、GA122、GA122-异黄酮(GA122-isolactone)、赤霉素 17(gibberellin 17)、4a-formyl-7alpha-hydroxy-1-methyl-8-methylidene-4aalpha，4bbeta-gibbane-1alpha，10beta-dicarboxylic acid、GA30、Gibberellin A44、GA54、GA60、GA63、gibberellin 7、GA77、GA87、3-O-p-coumaroylquinic acid、populoside_qt、hederagenin、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、菜油甾醇(campesterol)。与三棱有关的30个化合物中有4个符合标准，分别是反式性腺酸(trans-gondoic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芒柄花黄素(formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)。与莪术有关的81个化合物中有3个符合标准，分别是hederagenin、wenjine、二去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)。对这4味中药筛选出的46个化合物和其靶标构建分子-靶点网络，见图3。利用STRING数据库对46个化合物对应的97个靶蛋白构建PPI网络图(见图4)，经Cytoscape 3.5.1软件处理后，节点颜色越暗，代表Degree值越小。

图3 配伍中草药的成分-靶点网络图

图4 配伍药靶点的PPI网络图

2.4 制配伍中草药靶蛋白的重复情况及KEGG通路富集 利用VENNY 2.1绘制大黄、桃仁、三棱、莪术靶蛋白的文氏图(见图5)。其中，大黄、桃仁、三棱、莪术共有的靶蛋白有16个，分别是SCN5A、GABRA1、PTGS1、GABRA5、CYP2R1、CHRM2、PTGS2、CHRM3、CHRM1、PNRC2、PTGES3、IGHG1、PDE3A、GABRA2、ADRA1B、GABRA3。经KEGG通路富集分析结果显示，16个靶蛋白主要富集于(hsa04080)神经活性配体-受体相互作用通路(P=3.99×10-14)，参与该通路的蛋白有GABRA1、GABRA2、GABRA3、GABRA5、CHRM1、CHRM2、CHRM3、ADRA1B。

图5 大黄、桃仁、三棱、莪术靶蛋白的文氏图

2.5 配伍中草药靶蛋白核心子集的PPI网络图及富集分析 经Cytoscape 3.5.1的MCODE插件分析配伍中草药靶蛋白PPI网络，获得列其首位的核心子集(见图6)，该子集得分=20.846，含有27个蛋白，分别是CASP3、PPARG、HSP90AA1、CDKN3、FLT1、MAPK14、JUN、CASP9、TGFB1、MYC、PIK3CG、BAX、IL4、CHEK1、TP53、BCL2、F2、NOS2、PCNA、CCNB1、CDK2、NOS3、CALM1、IL1B、TNF、PTGS2、CASP8。利用KOBAS 3.0对这27个蛋白进行KEGG通路富集分析，该蛋白子集主要富集于乙型肝炎病毒、癌症通路、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)-晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的作用、肺结核、结直肠癌、弓形体病、p53信号通路、利什曼病、细胞凋亡、小细胞肺癌、美洲锥虫病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路、百日咳、铂类药物耐药、人类T型细胞淋巴病毒(human T-cell lymphotropic virus，HTLV-Ⅰ)感染、非酒精性脂肪肝、病毒癌变、神经营养因子信号通路等，见图7。

图6 配伍中草药核心子集靶蛋白的PPI网络图

图7 配伍中草药核心子集靶蛋白的前20个KEGG通路富集

2.6 水蛭素的靶蛋白PPI网络图及通路富集分析 利用CTD数据库预测出水蛭素的靶蛋白10个，分别是F2、SERPINE1、MPO、PDGFB、CGB3、CRP、F2R、F2RL3、P2RY12、SELP。利用STRING数据库对10个靶蛋白构建PPI网络(见图8)。用KOBAS 3.0对这10个蛋白进行KEGG通路富集分析(见图9)，该蛋白子集主要富集于补体和凝血级联、血小板活化、Rap1信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架、神经活性配体-受体相互作用、癌症途径、磷脂酶D信号通路、PI3K/Akt信号通路等。

图8 水蛭素靶蛋白的PPI网络图

图9 水蛭素靶蛋白的前8个KEGG通路富集

3 讨 论

中药多成分、多靶点、多层次的作用，使得其作用机制极其复杂。传统的单体-效应-机制的西药研究思路，忽视了中药多成分协同作用特点，难以解释中药复方的物质基础。本研究基于网络药理学方法，以目前单体、化合物等微观研究所获得的数据为基础，从含水蛭抗肿瘤经方的组方规律、核心配伍中药以及水蛭的起效单体、作用靶点、信号通路等几方面进行研究，推测它们之间的相互关系及可能机制，为研究含水蛭经方抗肿瘤机制提供理论参考依据。

3.1 含水蛭经方的出处、治疗范围及组方规律 肿瘤乃痼恶之疾，威胁着人类健康。早在《灵枢·刺节真篇》中就有“筋瘤”“肠瘤”“昔瘤”等记载。肿瘤被医家归属为“癥瘕积聚”的范畴，主要治疗手段有清热解毒[12]、活血化瘀[13]、扶正培本[14]、益气养阴[15]、软坚散结[16]、以毒攻毒[17]等。水蛭，味咸、苦，性平，有毒，能破血逐瘀，通经消症，主要治疗血瘀经闭、症瘕痞块、跌打损伤，临床上水蛭被用于治疗食管癌、胃癌、肠癌、子宫癌、乳腺癌等肿瘤且具有较好的疗效。本研究结果显示，《圣惠》《普济方》《千金》《圣济总录》等39部典籍有含水蛭的经方106个，主要应用于痛症、产后病、闭经、外伤疼痛、月经不调、腹腔肿瘤、骨折等14种疾病的治疗，这反映其具有“破血逐瘀，通经消症”之功效。其中明确用于治疗肿瘤相关疾病的方剂共10个，分别是摩挲丸、琥珀丸、桃仁丸、芫花散、通经散、加味抵当丸、水蛭饮、化蛊丸、大黄(庶虫)虫丸、愈黄丹。共涉及41味中草药，使用频率前10位的中草药依次为水蛭、虻虫、大黄、桃仁、干漆、琥珀、牛膝、三棱、莪术、肉桂，其中，水蛭、虻虫、大黄、桃仁、干漆、琥珀、三棱、莪术8味均为活血化瘀药。由此可推测，中医理论“活血化瘀”是含水蛭经方抗肿瘤的主要方式，主要应用于“实症”肿瘤患者。所有含水蛭的经方均将水蛭与虻虫联用，因水蛭性缓，虻虫性烈，联用功效相得益彰。

3.2 含水蛭经方主要配伍药的有效分子、靶点及其相互关系 本研究筛选的方剂均为口服方剂，在人体代谢过程中需要经过吸收、分布、代谢及排泄，因此以OB>30%且DL>0.18为筛选标准，在TCMSP数据库中筛选水蛭经方的主要配伍药的有效分子及靶点，获得大黄的有效分子16个、桃仁的有效分子23个、三棱的有效分子4个、莪术的有效分子3个，它们协同作用的靶蛋白共16个，主要参与神经活性配体-受体相互作用，因此考虑它们具有协同增强镇静、抗焦虑、抗惊厥作用[18]。大黄、桃仁、三棱、莪术有效成分的靶点主要参与乙型肝炎病毒、癌症通路等，而中国是HBV感染的大国，由此说明水蛭配伍使用大黄、桃仁、三棱、莪术时，可影响炎症和肿瘤的进程，进一步反映含水蛭抗肿瘤经方的疗效。

3.3 水蛭有效成分的主要靶点及其网络 水蛭主要有效成分水蛭素的靶点主要参与补体和凝血级联、血小板活化等通路，而肿瘤与血瘀密切相关，古有王清任《医林改错》曰“肚腹结块,必有形之血”。现代研究亦证实，恶性肿瘤患者普遍存在凝血异常，高凝状态易并发血栓的形成[19]。由此推测水蛭通过抗凝血、抗血栓参与肿瘤的治疗[20]。

此外，我们发现水蛭素和配伍中草药存在共同的靶蛋白F2(即凝血因子Ⅱ)，F2在发育和出生后维持血管完整性方面发挥作用，其突变导致各种形式的血栓形成和异常血栓，可能为潜在靶点。配伍药有效成分的靶点以及水蛭有效成分的靶点均参与PI3K/Akt信号通路。PI3K/Akt信号通路是细胞内最重要的信号通路之一,在促进细胞生长、增殖，促进细胞运动、侵袭，抑制细胞凋亡，促进血管生成，抵抗化疗并产生耐药等方面起到重要的作用。因此含水蛭的抗肿瘤经方可能同时具有协同抵抗耐药作用。

综上所述，含水蛭的抗肿瘤经方作用机制是多成分、多靶点、多层次的，涉及46种有效成分、97个靶点以及乙肝病毒、癌症通路、神经活性配体-受体相互作用、补体和凝血级联、血小板活化等多条通路。因此我们推测这类方剂作用机制主要体现在以下方面：(1)水蛭抗血栓形成，从而改善肿瘤微环境；(2)以F2为潜在靶点促进血管正常化，抑制血管生成，促进良性血管增生，增加化疗药物的抗肿瘤效果，以利于肿瘤治疗；(3)PI3K/Akt信号通路等通路抵抗化疗及耐药，从而增强抗肿瘤治疗的效果。本研究或为研究水蛭经方抗肿瘤机理提供了一个理论依据，也为中药复方药效物质探索提供一个新的思路、方法。