偏痛汤1号化学成分的UHPLC-LTQ-OrbitrapMSn快速鉴定研究※

● 王春国 宋慧荣 罗亚敏 李伊然 周冉冉 陶晓华

偏痛汤1号是北京中医药大学陶晓华教授治疗偏头痛的系列方之一，是在几十年的临床实践以及在其协定处方偏痛汤的实验和临床研究[1-2]基础上加减而成，该方由川芎、蔓荆子、地龙、僵蚕、珍珠母、夏枯草、红花、鸡血藤、细辛、白芍、甘草组成，具有化痰降浊、祛瘀止痛、升清疏散的作用，临床中对风痰互结、瘀浊内阻，又见清阳失布的偏头痛具有确切疗效。现代药理研究表明，偏痛汤1号对偏头痛模型大鼠具有明确的药效作用，其机制可能与其调节偏头痛神经源炎症反应的神经肽CGRP 蛋白表达下调，抑制CGRP 下游效应分子前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)的高表达有关[3]。方中川芎、蔓荆子为君，善活血行气、祛风止痛，协同为用。地龙、僵蚕、珍珠母、夏枯草、红花、鸡血藤共为臣药，化痰降浊、祛瘀止痛。细辛，入阴经，引药上行；白芍、甘草，取仲景甘酸化阴、缓急止痛之意，共为佐使。其中蔓荆子性清扬升散，引药上达巅顶，且止痛清热、利头目，为治疗头痛之要药，药理研究表明其有明显解热、镇痛、降压作用，其中紫花牡荆素为抗炎的主要活性成分之一[4]。细辛性温，善祛在里之风邪，除少阴之疼痛，药理研究表明其挥发油有显著的解热作用，所含成分β-细辛醚能降低血小板的活性，抑制血小板的聚集和黏附[5]。甘草可缓急止痛，治疗疼痛病之要药，药理研究表明其中的甘草次酸具有抗炎作用[6]。经临床应用和拆方研究，发现这三味药与偏头痛的疗效存在一定关系，对其进行复方中化学成分的提取和研究分析对今后临床治疗偏头痛有一定的参考价值。

偏痛汤1号中所含化学成分复杂，而对其化学成分的分析和阐释能够为偏痛汤1号的药效物质基础研究、新药开发、质量控制、体内代谢过程等提供数据参考，但是目前尚未有对偏痛汤1号化学成分分析的报道，严重阻碍了偏痛汤1号的进一步开发利用。LTQ-Orbitrap MS是将线性离子阱质谱和高分辨质谱结合的杂交型质谱仪，同时具有离子阱质谱的多级碎裂和Orbitrap的高分辨性能，是复杂中药化学成分定性研究的有力工具。本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技术建立偏痛汤1号提取物中化学成分快速分析和鉴定的方法，鉴定其主要化学成分，归属其可能的质谱裂解行为，并对偏痛汤1号中蔓荆子、甘草和细辛三味中药的特征性成分进行指认和归属，以期为偏痛汤1号的药效物质基础研究、质量控制和化学成分的快速鉴定提供参考。

1 试验材料

LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪：配有热喷雾离子源(HESI)、Xcalibur 2.1化学工作站(美国Thermo Scientific公司)；DionexUtimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统：含二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器(美国Thermo Scientific公司)；Millipore Synergy UV型超纯水机(美国Millipore公司)；Sartorious BT 25S 型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；超声波清洗器(北京中晟名科技有限公司，100 W)；0.22 μm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)；甲酸、甲醇(质谱纯，Fisher 公司)。

偏痛汤1号颗粒、蔓荆子颗粒、蔓荆子阴性颗粒、炙甘草颗粒、炙甘草阴性颗粒、细辛颗粒、细辛阴性颗粒购于北京中医药大学东方医院药房；甘草素(成都普菲德生物技术有限公司，批号：150511)；荭草苷(中国食品药品检定研究院，批号：111777-200801)；甘草次酸(宝鸡国康生物科技有限公司，批号 111215)。

2 实验方法

2.1色谱条件色谱柱AQUITY UPLC C18柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：0.1% 甲酸水溶液(A)，乙腈溶液(B)；梯度洗脱条件：0 ～ 3 min (5 % ～ 5 % B)，3 ～ 45 min (5% ～ 75% B)， 45 ～ 45.1 min (75% ～ 5 % B)，45.1 ～ 50 min (5 % ～ 5 % B)；流速： 0.3 mL/min；进样量： 2 μL；柱温：35℃。

2.2质谱条件正离子检出模式：HESI离子源，离子源温度350℃，电离源电压4 KV，毛细管电压：35V，管透镜电压110V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气流速40 arb，辅助气流速20 arb；负离子检出模式：HESI离子源，离子源温度350℃，电离源电压3 KV，毛细管电压35V，管透镜电压110V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气流速30 arb，辅助气流速10 arb。

正负离子数据采集均使用傅里叶变换高分辨全扫方式(TF，Full scan，Resolution 30000)数据依赖性(data-dependent acquisistion)ddMS3，运用CID碎解方式。

2.3供试品溶液的制备(1)偏痛汤1号供试品溶液制备：取偏痛汤1号颗粒剂约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，超声处理40 min，再称定重量，用50% 补足减失的重量，摇匀，滤过，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。(2)蔓荆子供试品溶液的制备：取蔓荆子颗粒约2 g，按上述同法制备。(3)蔓荆子阴性供试品溶液的制备：取除去蔓荆子的偏痛汤1号颗粒约2 g，按上述同法制备。(4)炙甘草供试品溶液的制备：取炙甘草颗粒约2 g，按上述同法制备。(5)炙甘草阴性样品的制备：取除去炙甘草的偏痛汤1号颗粒约2 g，按上述同法制备。(6)细辛供试品溶液的制备：取细辛颗粒约2 g，按上述同法制备。(7)细辛阴性供试品溶液的制备：取除去细辛的偏痛汤1号颗粒约2 g，按上述同法制备。

2.4对照品溶液的制备精确称取甘草素、荭草苷、甘草次酸适量，用甲醇溶解，配置浓度为1mg/mL的标准品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，备用。

3 结果与讨论

按照上述方法分析偏痛汤1号提取物，得到其在正、负离子模式下的总离子流图(见图1 A)。根据LC-MS检测得到的各化学成分保留时间、高分辨精确分子量、MSn多级碎片信息，并结合提取离子流图与标准品信息、Scifinder数据库及相关文献对其进行成分确认，共鉴定了126个成分，其中在正离子模式下所鉴定的数目为61种，负离子模式下所鉴定的数目为112种，47种化合物为正、负离子所共同鉴定的化合物(见图1B)。所鉴定得到的126种化学成分，包含57种黄酮类成分，14种三萜类萜类成分，14种酚酸类成分，10种单萜类成分，3种二萜类成分，8种香豆素类成分，4种木脂素，4种生物碱类成分和12种其它类成分(见图1C)。其中，通过对照品比对鉴定的化学成分有：甘草素、荭草苷、甘草次酸。

图1 LTQ-Orbitrap MS对偏痛汤1号主要化学成分的鉴定结果

注：A 偏痛汤1号在正离子和负离子模式下的总离子流图；B 正离子模式和负离子模式下鉴定偏痛汤1号化学成分的数目；C LTQ-Orbitrap MS鉴定偏痛汤1号中主要成分的类型

3.1标准品的质谱裂解行为黄酮类化合物：标准品甘草素在HESI负离子模式下，显示准分子离子峰为m/z255.06589 [M+H]-，元素组成为C15H12O5(质量误差-0.92ppm)。在MS/MS中产生m/z211.08、149.02、135.01、119.05等碎片离子(见图2 A)，其中碎片离子m/z135.01、119.05，是黄酮类化合物RDA1，3A-裂解产生的互补离子；选择丰度最高的m/z135.01进一步进行CID裂解，在MS3中产生的碎片离子主要为m/z90.87，为碎片m/z135.01母核丢失一分子CO2所形成，其具体的质谱裂解行为见图2 B。标准品荭草苷在HESI负离子模式下，其准分子离子峰为m/z447.09302 [M+H]-，元素组成为C21H20O11(质量误差-0.5815 ppm)，LTQ-Orbitrap多级质谱分析，MS2中呈现m/z327.05081，357.06116、429.08286等碎片离子(见图2C)。其中m/z429为准分子离子丢失一分子H2O所形成，m/z327.05081和357.06116是有黄酮碳苷键中葡萄糖不同的跨环裂解所形成的碎片离子，选择丰度最高的m/z327.05081进一步进行CID裂解，在MS3中产生的碎片离子主要为m/z299、255等，为黄酮母核中性丢失CO和CO2所形成，其具体的质谱裂解行为见图2 D。

三萜类化合物：标准品甘草次酸在HESI负离子模式下，显示准分子离子峰为m/z469.33133 [M+H]-，元素组成为C30H46O4(质量误差-2.13ppm)。在MS/MS中产生m/z451、425.34、409.31，355.26等碎片离子(见图2E)，其中碎片离子m/z451是准分子离子丢失一分子H2O所形成，碎片离子m/z425是甘草次酸C30位羧酸断裂丢失一分子CO2所形成，进一步丢失甲基(CH4)形成m/z409.31的碎片。选择丰度最高的m/z425.34进一步进行CID裂解，在MS3中产生的碎片离子主要为m/z355，为甘草次酸E环跨环碎裂丢C5H10所形成，其具体的质谱裂解行为见图2 F。

图2 标准品的MSn图和质谱裂解行为

注：A甘草素的MS2-3质谱图；B甘草素的质谱裂解行为图；C 荭草苷的MS2-3质谱图；D 荭草苷的质谱裂解行为图；E甘草次酸的MS2-3质谱图；F甘草次酸的质谱裂解行为图

3.2黄酮类化合物鉴定峰2和3的保留时间为13.05和18.54 min，其准分子离子峰均为m/z417.11859 [M+H]-，推测其元素组成为C21H22O9(质量误差-1.23 ppm)。在MS/MS中产生m/z255、135、119等二氢黄酮类化合物的典型碎片离子(见图3)，峰2和3的准分子离子峰与标准品甘草素相差162Da，推测为甘草素的单葡萄糖苷，通过文献比对，鉴定该化合物为甘草苷(Liquiritin)和新甘草苷( Neoliquiritin)[7]。峰4、5、7、8、9和10保留时间分别为18.22、13.84、21.76、19.84、19.73和10.84 min，其准分子离子峰分别为m/z549.16077、579.17092、692.19847、725.20764、695.19678、711.21307[M+H]-，推测元素组成分别为C26H30O13(质量误差-1.07 ppm)、C27H32O14(质量误差-1.72ppm)、C35H35NO14(质量误差-0.01 ppm)、C36H38O16(质量误差-1.47 ppm)、C35H36O15(质量误差-1.96ppm)、C32H40O18(质量误差-1.57 ppm)。这些峰在MS/MS中均出现m/z255二氢黄酮苷元的碎片离子峰，由此推测这些峰为甘草素(m/z255.06589 [M+H]-)连接不同糖苷键或相关官能团的同系组分，峰4与甘草苷相差132 Da，与甘草素相差294 Da(一分子葡萄糖和一分子呋喃糖)，结合文献鉴定为Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside[8]；峰5与甘草苷相差162 Da，与甘草素相差324 Da(两分子葡萄糖)，结合文献鉴定为Liquiritigenin 7，4'-diglucoside[9]；峰7与Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差143 Da，且峰7准分子离子峰为偶数，根据氮规则，推测其含有一个N元素，并结合文献鉴定其为Licorice glycoside E[10]；峰8与Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差146 Da，推测碎片为苯乙烯酸结构，结合文献鉴定为Licorice glycoside D1[10]；峰9与Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差176 Da(苯乙烯酸衍生物)，结合文献鉴定为Licorice glycoside C1[10]；峰10与Liquiritigenin 7-apiofuranoside-4'-glucoside相差162 Da(一分子葡萄糖)，结合文献鉴定为Liquiritigenin 7-glucoside-4'-apiosyl-(1->2)-glucoside[11]。

在HESI负离子模式下，峰16、17、18、19、20和21保留时间分别为15.2、11.50、11.84、12.80、12.90和14.62 min，其准分子离子峰分别为m/z473.10893、593.15002、579.13464、579.13464、563.13977、 577.15521 [M+H]-，推测元素组成分别为C23H22O11(质量误差-0.01 ppm)、C27H30O15(质量误差-1.97 ppm)、C26H28O15(质量误差-1.56 ppm)、C26H28O15(质量误差-1.56 ppm)、C26H28O14(质量误差-1.52ppm)、C27H30O14(质量误差-1.85 ppm)。这些峰在MS/MS中均出现一个或多个[M-120]-和[M-90]-的碎片离子峰，推测这些峰为黄酮碳苷类化合物。结合文献鉴定这些峰分别为：Vitexin 2''-acetate，Vicenin 2，Lucenin 1，Lucenin 3，Vicenin 1，Violanthin[12-14]。综上，基于标准品的裂解规律、高分辨质谱提供的精确分子量、MSn多级碎片信息等，在正离子和负离子模式下共有56种黄酮类化合物在偏痛汤1号中得以被鉴定和表征。

图3 黄酮类主要成分的MS/MS图

3.3三萜萜类化合物鉴定在HESI负离子模式下，峰59、60、61、62、63、64、65、66、67、68和69保留时间分别为35.15、 30.68、32.70、26.89、28.84、30.51、25.78、27.72、32.06 、31.58和35.48 min，其准分子离子峰分别为m/z805.40039、821.39514、821.39569、837.39044、837.39032、837.39014、983.44781、819.38085、807.41583、807.41595和807.41614 [M+H]-，推测元素组成分别为C42H62O15(质量误差-1.49 ppm)、C42H62O16(质量误差-1.66 ppm)、C42H62O16(质量误差-0.99 ppm)、C42H62O17(质量误差-1.17 ppm)、C42H62O17(质量误差-1.31 ppm)、C42H64O15(质量误差-1.53 ppm)、C42H62O17(质量误差-1.54 ppm)、C48H72O21(质量误差-1.54 ppm)、C42H60O16(质量误差-0.01 ppm)、C42H64O15(质量误差-1.75 ppm)和C42H64O15(质量误差-1.36 ppm)。这些峰在MS/MS中均出现一个或多个[M-176]-和[M-162]-的碎片离子峰，推测这些峰为含有1个多个葡萄糖醛酸和葡萄糖苷键的化合物，且MS/MS中出现m/z469、453、485等甘草次酸类五环三萜母核的碎片离子，如峰60、65在MS/MS均出现m/z469(甘草次酸)的诊断离子(见图4)，而碎片离子m/z645(峰60)为准分子离子丢失一分子葡萄糖醛酸所形成，碎片离子m/z821、645、469(峰65)为准分子连续离子丢失一分子葡萄糖和2分子葡萄糖醛酸所形成，结合文献分别鉴定峰60、65为甘草酸(Glycyrrhizic acid)和Licoricesaponin A3[15-16]。同理，基于标准品的裂解规律、高分辨质谱提供的精确分子量、MSn多级碎片信息等，在正离子和负离子模式下共有14种三萜皂苷类化合物在偏痛汤1号中得以被鉴定。

图4 三萜皂苷类主要成分的MS/MS图

3.4酚酸类化合物鉴定在HESI负离子模式下，峰72、73、74、75、76、77、78、79、80和81保留时间分别为24.98、7.86、3.33、5.40、10.51、7.29、6.29、3.11、8.50和23.08 min，其准分子离子峰分别为m/z119.05051、151.04002、153.01935、137.02455、165.0921、179.03498、165.05565、167.03482、167.03485和193.05043 [M+H]-，推测元素组成分别为C8H8O(质量误差2.28 ppm)、C8H8O3(质量误差-0.31 ppm)、C7H6O4(质量误差0.11 ppm)、C7H6O3(质量误差0.96 ppm)、C10H14O2(质量误差-0.19 ppm)、C9H8O4(质量误差-0.11ppm)、C9H10O3(质量误差-0.41 ppm)、C8H8O4(质量误差-0.96 ppm)、C8H8O4(质量误差-0.79 ppm)和C10H10O4(质量误差-1.04 ppm)。对这些峰的MSn多级碎片信息进行归属，在正离子和负离子模式下共有14种酚酸类化合物在偏痛汤1号中得以被鉴定。

3.5其它类化合物鉴定在HESI正离子和负离子模式下，共有10种单萜类化合物和3种二萜类化合物在偏痛汤1号中得以被鉴定和表征，如峰89的保留时间为17.56 min，其准分子离子峰均为m/z479.155612[M+H]-，推测其元素组成为C23H28O11(质量误差-0.56 ppm)。在MS/MS中产生m/z435、357.11844、327.10791、283.08182等碎片离子(见图5)，其中m/z435是芍药内酯苷结构中内酯环中酰氧基两侧断裂，丢失一分子CO2产生的碎片离子，m/z357.11是准分子离子丢失一分子苯甲酸所产生的碎片离子，而m/z327碎片离子则是丢失准分子离子丢失一分子葡萄糖形成的，通过文献比对，鉴定峰89为芍药苷[17]。

另外，在HESI正离子和负离子模式下，共有8种香豆素类化合物、4种木脂素类化合物、4种生物碱类化合物和12种其它类化合物在偏痛汤1号中得以被鉴定。

图5 峰89(芍药苷)的MS/MS图

3.6蔓荆子、炙甘草和细辛中特征成分的指认和归属

按照上述方法分析蔓荆子单味药提取物、偏痛汤1号提取物以及偏痛汤1号除去蔓荆子提取物，得到其在正、负离子模式下的总离子流图(见图6A)。基于上述研究获得的126种化学成分，对蔓荆子中特征成分进行指认和归属，共鉴定到17种化学成分为蔓荆子特有成分。同理，对炙甘草中特征成分进行指认和归属，共鉴定到60种化学成分为炙甘草所特有(见图6B)；对细辛中特征成分进行指认和归属，共鉴定到5种化学成分为细辛所特有(见图6 C)。

图6 偏痛汤1号、主要单味药及其阴性样品的总离子流图

4 结论

本研究采用UHPLC-LTQ OrbitrapMS方法对偏痛汤1号提取物中主要化学成分进行了系统研究，并对偏痛汤1号中蔓荆子、甘草和细辛三味中药的特征性成分进行了指认和归属。该方法能够实现偏痛汤1号中126种化学成分的快速鉴别，可为偏痛汤1号的药效物质基础研究、质量控制和化学成分的快速鉴定提供数据参考，亦可为复杂中药成分的快速定性分析提供借鉴。