石萆汤对弱精子症患者精子线粒体膜蛋白PHB及超微结构的影响※

● 程宛钧 张敏建 史亚磊 危椠罡 江 澍 程标建 詹华深 邓日森 曾智承

弱精子症是当前引起男性不育症的主要因素之一，其发生多与泌尿生殖道感染、内分泌失调、精索静脉曲张[1]、遗传等因素相关[2]，药物治疗改善精液质量是提高患者配偶妊娠成功率的有效途径。临床研究发现，精子线粒体结构和功能均与男性不育症患者精子活力呈正相关性[3，4]，在临床评估精子质量方面有一定应用价值，部分学者还指出中医药在改善精液微观成分方面有良好的优势[5]。因此，本研究选取肾虚夹湿型弱精子症患者和生殖体检者为研究对象，研究石萆汤对精子线粒体膜蛋白PHB和超微结构的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2016年8月-2018年6月于福建中医药大学附属人民医院男科门诊就诊的肾虚夹湿型弱精子症患者(60例)、生殖体检正常者(30例)、生殖体检弱精子者(30例)为研究对象。将生殖体检其中正常者纳入正常精液组(N组，n=30)，其年龄为(37.36±4.21)岁，体质量(BWI)为(24.78±1.57)kg/m2检测为弱精子但暂未要求给予治疗者纳为弱精子症组(A组，n=30)，其年龄为(37.18±4.40)岁，BWI为(24.07±1.49)kg/m2，病史为(2.11±0.36)年；确诊为肾虚夹湿型弱精子症的60例患者作为石萆汤治疗组(T组，n=60)，其年龄为(37.89±4.36)岁，BWI为(24.15±1.60)kg/m2，病史为(2.09±0.38)年。三组患者在年龄、体质量(BWI)等一般资料对比上差异无统计学意义(P>0.05)，A组、T组在男性不育病史对比上差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2纳入标准①已婚或有固定性伴侣且共同生活12个月以上，性生活中未采取任何避孕措施而女方未受孕者；②西医诊断标准参考《实用量科学》及文献[6，7]中弱精子症相关诊断标准，中医诊断标准参考《中药新药临床研究指导原则》[8]中肾虚夹湿型弱精子症相关诊断标准者；③20岁～50岁的男性；④临床资料完整者；⑤参与研究经我院医学伦理委员会批准者；⑥自愿签署知情同意书者。

1.3排除标准①合并先天性生殖系统发育不良或畸形、严重器质性病变、自身免疫性疾病、生殖道感染疾病、内分泌疾病、代谢性疾病、重要脏器功能不全者；②合并恶性肿瘤者；③合并精神疾病、意识障碍者；④拒绝参与本次研究者；⑤研究入组前90d使用影响性腺功能、睾丸生精功能的药物者；⑥配偶或固定性伴侣确诊为妇科不孕症者；⑦过敏体质或相关治疗禁忌证者；⑧治疗依从性不足者。

1.4方法

1.4.1 治疗方法 A组主要予以健康宣教，暂未接受相关药物治疗措施；T组给予石萆汤：萆薢、石菖蒲、菟丝子、枸杞子各20g，黄芪30g，黄精、女贞子、连翘、墨旱莲各15g，五味子、怀牛膝、覆盆子各10g，由我院全成分智能中药房配制为中药配方颗粒剂，每日1剂，分早晚两次冲服，持续16周。

1.4.2 精液采集方法 三组受试者均自行采集精液，禁欲7d后在取精室内经手淫方式获取全部精液并置入统一配发的一次性带盖取精杯内；三组中A组及N组受试者入组时完成精液的采集工作，T组患者口服石萆汤16周后，按上述方法采集精液。

1.4.3 检测方法

1.4.3.1 精液质量检测 将采集的精子静置于37℃恒温水浴箱中使之液化，记录精液量；精子密度、精子(a+b)级活动力、精子成活率等精子质量指标由男科实验室采用徐州北斗科贸公司生产的BD-8000G型计算机彩色精液分析仪(CASA)进行分析。

1.4.3.2 精子线粒体膜蛋白PHB表达的荧光检测 将一部分调整后细胞密度约为10×106/L的精子悬液，重悬于精子细胞BWW培养液中，在培养箱中处理45min之后彻底洗净精子细胞用于线粒体荧光检测试验。加入配置好的37℃预温的Mito-Tracker染色液共孵育15min。洗涤去除MitoTracker染色液，加入37℃预温的精子细胞BWW培养液。取干净载玻片上加5μl经MitoTracker染色后的精子悬液，取四角垫着适量凡士林的清洁盖玻片压片，使精子细胞尽量集中在盖玻片中心区域且无挤靠，用羊毛脂密封住盖玻片和载玻片接触边缘，室温下晾干，置于暗处待测，在波长561nm激光LSCM下观察红色荧光并拍照。照片用Leica图像分析软件处理，比较荧光强度情况，分析精子线粒体膜蛋白PHB表达的强弱。

1.4.3.3 精子线粒体超微结构检测 参照文献[3]将三组精液标本移入细胞培养管，3000 r/min离心10min。弃上清液，将沉淀物用2.5%戊二醛固定，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位后超薄切片，用透射电子显微镜(Hu-12A，日本日立公司)重点观察精子中段线粒体的改变情况并拍片。正常线粒体大小标准：精子线粒体直径大小为0.5～1.0μm，呈椭圆形细胞器。排列规则，线粒体嵴可见，头尾连接紧密正常[9]。

1.5主要观察指标观察比较三组受试者精子质量指标[精液量、精子密度、精子(a+b)级活动力、精子成活率]、精子细胞线粒体膜蛋白PHB荧光强度、阳性细胞比例以及精子细胞线粒体超微结构的变化。

1.6统计学方法应用统计学软件SPSS19.0分析数据，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1精子质量指标比较分析三组受试者除精液量比较无统计学意义(P>0.05)外，N组受试者精子密度、精子(a+b)级活动力及精子成活率均明显高于A、T两组，且T组上述指标检测结果明显高于A组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组精子质量指标检测结果比较

注：与N组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与A组比较，▲P<0.05

2.2三组精子线粒体功能评估分析经MitoTracker荧光探针(图中为红色荧光)检测显示，N组精子染色可见棒状精子中段结构(见图1-N组)，T组可见较短或屈曲的精子中段结构(见图1-T组)，A组可见变形的精子中段结构(见图1-A组)；A、T组精子荧光强度明显弱于N组。见图1。

图1 三组患者精子线粒体膜蛋白PHB表达情况(激光波长561nm观察红色荧光)

通过图像标记计数，计算精子线粒体膜蛋白PHB阳性细胞比例。N组受试者精子线粒体膜蛋白PHB阳性细胞比例明显高于A、T两组，且T组高于A组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组精子线粒体膜蛋白PHB阳性细胞比例比较

注：与N组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与A组比较，▲P<0.05

2.3精子细胞线粒体超微结构的变化经透射电镜对三组精子线粒体超微结构的观察发现N组精子线粒体鞘完整，轴丝及微管结构清晰。A组精子呈现空泡状，线粒体肿胀、大小不一，轴丝出现明显断裂，微管缺失。T组精子精子线粒体肿胀明显减轻、线粒体鞘基本完整、轴丝微管结构较完整。见图2。

图2 三组患者精子线粒体超微结构变化情况

3 讨论

据不完全资料统计，男性不育症已成为影响社会新生人口增长的主要因素之一[10]，弱精子症作为目前男性不育的常见致病因素，其临床诊疗受到学者们的广泛关注[11]。

祖国医学将弱精子症纳入“无子”“无嗣”范畴，认为该疾病以肾精亏虚为本、湿阻精窍为标[11]，需以益气补肾、强精除湿为治法[12]，方可获得理想的治疗效果。石萆汤是福建省名中医张敏建教授应用多年的治疗男性不育症的经验方，具有益肾强精、通窍除湿的功效，以利湿化浊的萆薢及化湿开窍、醒神益智的石菖蒲为君药，辅以补肾生精的黄精、墨旱莲、五味子、覆盆子、女贞子等臣药可共奏强精益肾、利湿化浊的功效。本研究也发现，予以石萆汤口服16周治疗的T组患者精子质量评估指标检测结果均明显优于未接受相关治疗的A组患者，同安琪等[13]报道的系统评价结论基本一致，证实石萆汤对改善男性不育肾虚夹湿型弱精子症患者精子活力及质量、促进其病情转归等方面有积极作用。

精子线粒体是精细胞的重要细胞器，而精子线粒体膜蛋白PHB反映着精子线粒体的功能状态，是其敏感指标之一。因为精子线粒体同时介导精细胞的凋亡，主要表现为精子线粒体的膜蛋白PHB下降，逐步引起精子线粒体结构的变化，而出现功能异常，精子的运动能力下降。本研究显示，T组经过石萆汤16周的治疗，运用LSCM以及透射电镜的检测观察发现，有明显增强精子线粒体膜蛋白PHB的作用(荧光强度增加)；改善精子线粒体结构，趋于恢复至正常的精子结构和形态。

综上所述，石萆汤能够对精液质量尤其活率和活力方面有明显的治疗作用，其分子生物机制在于通过提高精子线粒体膜蛋白PHB表达来减弱精子细胞凋亡的发生，进而改变精子线粒体的超微结构，恢复和提高精子的运动能力，达到临床上运用石萆汤治疗肾虚夹湿型弱精子症的目的。