芦荟多糖与大黄素配伍对人舌鳞状癌细胞活力及VEGF表达的影响※

● 李 静 陈 力 王 丹 陈 燕

舌癌(carcinoma of the tongue)是口腔颌面部中最常见的恶性肿瘤之一[1]，多项研究证实近些年来舌癌的发病率在全球范围内呈现不断上升的趋势[2]。研究显示，天然中草药中的有效成分或有效部位，比如具有药理功能的化合物或者生物碱，已成为目前抗癌研究的热点。大黄素是一种蒽醌类物质，大黄素具有抑制口腔鳞癌细胞株的增殖、并影响其细胞周期的作用[3]；芦荟具有较高的食用和药用价值，其中芦荟多糖(Aloe polysaccharide，AP)是芦荟凝胶中的主要生物活性物质，具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种功效[4]。因此，本文拟通过对芦荟多糖与大黄素不同配伍比例，考察中药提取物对SCC15活性的影响；同时，血管内皮生长因子(VEGF)能促进血管的形成，在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[5]，是肿瘤细胞发展过程中重要的生化指标。基于此，本文拟通过研究芦荟多糖与大黄素不同配比体外干预SCC15的活性，研究对VEGF蛋白表达的影响，初步探讨其作用机制，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1试剂无外泌体胎牛血清(上海宇玫博生物科技有限公司：UR50201)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司，批号：904862)；SCC15口腔癌细胞(购自上海拜力生物有限公司)；免疫印迹抗体：山羊抗小鼠IgG标记二抗(Biosharp公司，批号：zs-256)；β-acting(博奥森，批号：160517)；VEGF分装单克隆抗体(北京中杉，批号：20160717)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司：0931)；二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司，批号：0331)；磷酸盐缓冲液(PBS)(武汉博士德)；ECL发光液(碧云天，批号：20160720)；胰酶(Biosharp公司，批号：20170530)；芦荟多糖(江苏瑞多生物，批号：20161124，含量70%)；大黄素(CAS：518-82-1，货号：SF0024，陕西森弗)。

1.2主要仪器倒置显微镜(上海巨纳科技)；超净工作台(苏州安泰)；CO2培养箱(日本三洋)；S3006L型高压匀质机(Niro Soavi公司)；酶标定量测定仪(Thermo Multiskan AsCant公司)；冷冻干燥机(abeonco)；垂直电泳仪、转膜仪(北京六一)。

1.3细胞培养(1)细胞复苏：SCC15人舌鳞状癌细胞购自上海拜力生物有限公司，将细胞从液氮灌中取出，迅速投入37℃超纯水中解冻，转移至离心管中，加4mL DMEM高糖培养基，离心1500 r/min×2min，弃去上清，加入5mL完全培养基(10%胎牛血清)，用巴士吸管轻轻吹打，将细胞吹散均呈悬浮状态，再将细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。(2)细胞培养及传代：待细胞长至瓶底80%以上时，加入1mL 0.25%的胰酶消化(约1min)，然后4mL加入含10%血清的培养基终止消化，离心1500 r/min×2min，收集细胞，再加入适量完全培养基(10%胎牛血清)轻轻吹打至悬浮，分别传代至2～3个培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中继续孵育；传3代待细胞生长稳定后便可用于下一步实验。

1.4细胞鉴定取进入对数生长期的细胞进行消化，离心后接种于无菌的盖玻片上，置于二氧化碳培养箱中继续培养，当细胞生长铺满至玻片的50%～80%时，弃去培养液，PBS清洗1遍后，分别加入丙酮、甲醇各1mL，室温固定30min，弃上清，以PBS清洗3次，再加入3%H2O2去离子水室温孵育10min，弃上清，以PBS清洗3次，加入封闭用山羊血清在室温下继续孵育30min，再滴加c-kit一抗(1∶200)适量，将封闭后的玻片置于冰箱冷藏过夜，取出后再滴加山羊抗小鼠IgG标记二抗(1∶100)，置二氧化碳培养箱中继续孵育30 min后，在避光条件下置于电子显微镜下观察[6]。

1.5 MTT法测细胞增殖[7]取进入对数生长期的细胞，消化后稀释并将细胞密度调整为2×104个/mL，接种于24孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，将细胞分为空白组、阳性组、芦荟多糖高、中、低剂量组，每组6个复孔。根据《药典》中成人最大剂量/人血浆容积(4000mL)换算芦荟多糖的最大剂量为0.225μg/mL、大黄素的最大剂量为0.056μg/mL。空白组：SCC15给予不含药DMEM完全培养液，培养48 h；给药组：给药剂量及比例见表1。

表1 不同配伍比例给药剂量

各给药组的SCC15口腔癌细胞培养24 h后，分别根据给予含芦荟多糖与大黄素不同配伍比例的DMEM完全培养液，以上各组药物干预后培养24h后，每孔加入20μL 5mg/mL的 MTT溶液，在CO2培养箱中继续放置4h后，弃上清，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，于摇床上振荡10 min，酶标仪中设定490 nm波长处读取各组的OD值，计算均值、比较各组细胞的增殖情况。

1.6 Western-blot检测VEGF蛋白的表达[8]药物干预后收集各组细胞，分别加入100 uL裂解液(Tris pH=7.5，1 mM EDTA中，50 mM NaCl，0.5%Triton-X-100)，振摇，并将温度保持为4℃，持续30min，裂解后再将各组细胞以5000 r/min×10 min离心，收集上清液，转入预冷的离心管中，根据考马斯亮兰试剂盒检测各组细胞裂解后的蛋白浓度；样品中加入上样缓冲液稀释，并煮沸5min使蛋白变性，备用。SDS-PAGE凝胶上样量50 μL，在150 V的稳压电场中电泳约90min，电泳后转移蛋白至硝酸纤维素滤膜(电流为380 mA)，最终加入脱脂奶粉封闭，室温下过夜，剪膜，根据分子量分开后分别以加1∶500稀释的一抗(VEGF)及内参抗体(β-acting，1∶2000)室温孵育2 h，HRP标记二抗(1∶1000)孵育1 h后，洗膜，ECL发光液发光后X光片曝光，扫描记录结果，Gel-analyze 分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，以IOD值表示蛋白的表达水平。

2 结果

2.1 c-kit免疫荧光鉴定和细胞形态细胞贴壁后，逐渐伸展，细胞密度低时排列疏松，形态特征明显，呈长条形或不规则形态，生长进入对数后，细胞增殖加快，体积变大且排列紧密，呈放射状(图1)；免疫染色后，胞体和突起明显着色，与邻近细胞相互连接成网状(图2)。图片均在100倍镜下观察并拍照。

图1 (空白组×100)

图2 (c-kit免疫染色×100)

2.2 MTT检测细胞增殖情况与空白组比较，芦荟多糖单剂量组、大黄素单剂量组、各配伍组的细胞活性均显著降低(P<0.05)，且随大黄素比例的增加抑制作用而增强，其中以芦荟多糖与大黄素配伍1∶2组、2∶3、1∶3组最为显著(P<0.01)，差异具有统计学意义。实验结果见表2。

表2 各组对SCC15口腔癌细胞增殖的影响

注： 与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3 VEGF蛋白表达的变化结果显示，空白组VEGF蛋白的表达较高，各给药组VEGF蛋白表达降低，其中芦荟多糖配大黄素1∶2、2∶3、1∶3组VEGF蛋白的表达显著减弱，且当比例为1∶3时，VEGF蛋白的表达最低。说明：在本次实验中，VEGF在SCC15口腔癌细胞中具有较高表达，大黄素与芦荟多糖配伍对VEGF蛋白的表达有显著抑制作用，且以1∶3的比例效果最显著。结果如表3、图3所示。

表3 VEGF/内参(IOD比值)的情况

注： 与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01

图3 各组VEGF蛋白的表达

(A代表空白组；B表示芦荟多糖单剂量组；C表示大黄素单剂量组；D表示芦荟多糖配伍大黄素1∶2组；E表示配伍2∶3组；F表示配伍1∶3组)

3 讨论

舌癌多数为鳞癌，恶性程度高，生长快，浸润性强，此外舌体还具有丰富的淋巴及血运循环，加之其频繁的机械运动，使得舌癌极易在发病的早期出现颈部淋巴结转移，预后较差[9]。中医学认为舌癌归属于中医“舌疳”与“舌菌”范畴，发病病因主要是外感六淫，内伤七情，入里化火，火性炎上，舌上便生溃疡，加之吸烟，火毒熏烤，或阴虚火自内生，迫使火毒淤结，从而致生舌癌[10]。目前舌癌治疗中医治疗方法初期主要清热解毒，清泻心火，行气化癖，除湿化浊，后期主扶正祛邪，攻补兼施，治宜补益心脾，清热解毒之法[11]。而西医方法主导的是以手术为主的综合序列治疗，虽然近些年来舌癌的手术切除率已明显提高，手术患者的病死率明显下降，但其局部、区域性复发及转移率仍然较高[12]，因此，寻找出毒副作用低且对肿瘤增殖及侵袭转移有抑制作用的药物具有重要的现实意义。芦荟多糖(Aloe polysaccharide，AP)是芦荟凝胶部分除去水分以外的主要成分，AP作为药用品种芦荟的主要活性物质之一，其抗肿瘤作用备受关注[13]。有研究显示，芦荟多糖对S180、H22荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用，延长小鼠生存期[14]。大黄素是一种蒽醌类物质，最新研究显示，大黄素能够抑制小鼠肝癌、乳腺癌、艾氏腹水癌、淋巴肉瘤、黑色素瘤以及大鼠瓦克瘤，抑制率大于30%[15]。此外大黄素具有抑制口腔鳞癌细胞株的增殖并影响其细胞周期的作用。因此，本文拟通过体外培养SCC15细胞，观察芦荟多糖与大黄素不同配伍比例对其是否具有抑制作用及部分作用机制。

VEGF通过血管内皮细胞表面VEGFR2受体激活下游信号，可诱导内皮细胞的生长、迁移和管状形成，促进新生血管形成、提高血管通透性，满足肿瘤细胞对氧和营养的需求，因此，阻断VEGF-VEGFR2信号通路抑制血管异常增生是肿瘤靶向治疗的重要策略[12]。本研究中，通过MTT法检测细胞活性，发现芦荟多糖、大黄素单剂量组及其不同比例的配伍组对体外培养的SCC15细胞具有显著的抑制作用，且细胞活性随随大黄素比例的增加而逐渐降低。根据细胞活性中的结果，将空白组、芦荟多糖与大黄素单剂量组、芦荟多糖配大黄素1∶2、2∶3组通过免疫印迹法检测VEGF蛋白的表达的检测，结果显示：肿瘤细胞SCC15中对VEGF具有高表达，给予药物干预后，各单剂量组及配伍组均能抑制VEGF的表达，其中以芦荟多糖配大黄素1∶3组尤为显著，说明芦荟多糖与大黄素配伍可能通过下调VEGF蛋白的高表达从而抑制SCC15细胞的增殖能力，在体外芦荟多糖与大黄素以1∶3的比例干预，具有较好的抗肿瘤作用。

综上所述，芦荟多糖与大黄素配伍能降低SCC15细胞VEGF蛋白的高表达，从而达到抗瘤作用，但本研究仅研究了部分机制且为体外研究，下一步可选择观察含药血清对SCC15细胞的抑制作用或口服汤剂对在体荷瘤小鼠的治疗作用，其作用通路及相关基因蛋白还有待进一步研究。