高迁移率族蛋白1基因多态性与少儿过敏性紫癜肾炎的相关性分析

李 为 王黎萍 梁亚君

过敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)是最常见，且有一定自限性的毛细血管和细小血管炎性疾病，好发于儿童。该疾病临床表现除皮肤紫癜外，还可引起腹痛、关节炎以及肾脏病变，过敏性紫癜性肾炎(Henoch-Schonlein Purpura Nephritis，HSPN)是其最严重的并发症。HSPN发病机制尚未完全明确，研究认为与遗传、感染等有关[1,2]。随着人类基因学研究的深入，已有大量研究[3-7]认同，一氧化氮合酶(NOS)，金属蛋白酶9(MMP9)，白细胞介素-17(IL-17)，热休克蛋白70-2(HSP70-2)，白细胞介素-1β(IL-1β)等的基因多态性与HSPN易感性有关。高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Protein-1，HMGB1)是一类非组蛋白染色体结合蛋白，作为核蛋白在细胞外发挥重要生物学作用，促进机体炎症反应，参与自身免疫或其基因多态性与一些免疫性疾病有关联性等[8-10]。但HSPN的发生是否与HMGB1基因多态性相关，国内外目前未见报道。 本研究通过测序方法检测湖北十堰地区HSPN少儿患者HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125位点单核苷酸多态性(SNPs)，探讨HMGB1基因多态性与HSPN易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016—2018年在湖北十堰地区有关医疗机构住院的HSPN少儿患儿278例(HSPN组)，男142例，女136例，发病年龄为4—15岁,平均(7.98±2.03)岁。HSPN诊断参照2009年中华医学会儿科学分会肾脏病学组修订的紫癜性肾炎诊断与治疗标准[11]。有确切的皮肤紫癜病史，尿检异常：并排除血小板减少性紫癜及系统性红斑狼疮等全身性疾病。对照组为相同医疗机构门诊体检正常的225例少儿(对照组)，男124例，女101例，年龄为4—14岁,平均(7.68±2.10)岁。两组在性别、年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象之间无血缘关系，且均签署了知情同意书。

1.2 外周血DNA提取

采集两组空腹外周血2 ml，EDTA-K2抗凝。按照DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，TIANamp Blood DNA Kit DP348)操作方法提取DNA，保存于-70℃备用。

1.3 HMGB1基因多态性位点选择

根据生物信息数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)与参考文献等资料，本研究选择HMGB1 3个基因多态性位点：rs1045411、rs2249825和rs1412125，以上位点目前研究较多且与很多疾病的发生发展有一定关系。

1.4 HMGB1基因多态性检测

1.4.1引物：从NCBI Genebank查获参考序列(NC_000013.11)，采用Oligo 7.0软件自行设计PCR扩增引物序列如表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HMGB1基因多态性与引物序列

1.4.2PCR扩增：采用TAKARA公司PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行 PCR扩增，其中反应体系均为40 μl，含Premix 20 μl、Temple 10 μl、上下游引物(10 μmol/μl)各1 μl、ddH2O 8 μl。PCR反应条件：98℃变性10 s，63 ℃退火5 s，72℃延伸10 s，40个循环。

1.4.3扩增产物电泳与测序：取PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后采用凝胶图像处理系统进行成像拍照，预估本实验扩增片段的分子量大小。对所有PCR产物进行纯化并测序，测序引物为PCR扩增上游引物，测序仪器型号为ABI 3500DX，测序结果与GeneBank进行比对。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件分析，Hardy-Wein berg平衡采用χ2检验，P>0.05表示采样符合Hardy-Weinberg遗传平衡。两组间等位基因、基因型频率、单体型与疾病关联分析均采用χ2检验并计算比值比(Odds Ratio，OR)和95%可信区间(Confidence Intervals，CI)。所有统计检验均为双侧概率检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 HMGB1基因测序分析

将纯化PCR产物进行测序，分别检测到HMGB1基因3个多态性位点rs1045411、rs2249825和rs1412125的野生型纯合子、杂合子与突变型纯合子，其基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。见图1，表2。

表2 HMGB1基因Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.2 两组HMGB1基因型在不同遗传模式下分布及与HSPN的关系

在超显性、显性与隐性遗传模式下，HMGB1位点各基因型分布在HSPN组与对照组之间差异均无统计学意义(P>0.05)，且与HSPN的发生风险无关(P>0.05)，见表3。

2.3 两组HMGB1等位基因、基因型和单体型分布及与HSPN的关系

HSPN组HMGB1基因各位点等位基因、基因型以及单体型AGC、GCC、GCT与对照组分布差异均无统计学意义(P>0.05)，只有HSPN组单体型ACC分布的组间差异具有统计学意义(P<0.01)。等位基因、基因型与HSPN无明显关联(P>0.05)，只有单体型与HSPN发生的关联性较强(P<0.01)。见表4。

3 讨 论

宿主遗传基因与HSPN易感性关系的研究已有较多报道[3-7]。HMGB1作为一种重要的晚期炎症介质，可通过与靶细胞表面受体结合，活化细胞内信号转导途径，上调白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎因子表达。同时激活巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞，更多表达HMGB1，触发瀑布式级联效反应，不断加重机体炎症和损伤[12-14]，但HMGB1基因多态性与HSPN的发生有否关联，国内目前尚未见报道。

本文选择HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125三个位点在湖北十堰地区HSPN人群中的分布研究，结果表明，不同遗传模式下HMGB1基因型分布在对照组与HSPN组无明显差异，HSPN组rs1045411、rs2249825和rs1412125等位基因及基因型分布与对照组分布差异亦无统计学意义(均P>0.05)。而HMGB1基因rs1045411、rs2249825和rs1412125单体型ACC在HSPN组与对照组的分布差异具有统计学意义(P<0.05)，提示该单体型可能与增加HSPN风险有关(OR=2.044, 95% CI=1.220-3.425,P<0.01)，即HMGB1基因rs1045411等位基因G突变为A，rs2249825等位基因为野生型C，rs1412125等位基因T突变为C时可能会促进HMGB1从细胞内释放到细胞外，进而改变生物学活性，发挥促炎作用，加重慢性炎症，促进HSPN的发生。

表3 不同遗传模式的SNP位点分析

表4 两组HMGB1等位基因基因型和单体型分布及关联性分析

综上所述，HMGB1基因多态性检测有利于临床HSPN易感人群的筛选、早期预防、诊断和治疗。由于基因多态性与HSPN发病风险之间存在遗传异质性，不同地区、不同种族、不同环境可能出现研究不同结果，因此，本文结果尚不能确定该基因是HSPN的易感基因。有待于进一步多中心、大样本研究。