落葵种子色素提取及其抑菌作用研究
2019-03-18杨海韫卢坤王庭欣
杨海韫，卢坤，王庭欣
(河北大学 质量技术监督学院，河北 保定 071000)
落葵为落葵科落葵属中以嫩茎叶供食用的一年生缠绕性草本植物[1]。成熟的果实为紫红色，其浆汁内有大量甜菜花青素和甜菜红色素[2]。资料显示落葵色素具有抑菌、保鲜的作用[3]，常用作香肠和化妆品的着色剂，与红曲色素有着类似的着色效果[4]。近年来有关落葵色素的研究多集中于对其化学性质的研究，对其提取条件的探究报道较少[5，6]。为落葵色素的开发利用，本研究对其提取条件进行了探讨并对其抑菌作用进行了初步研究，为落葵种子色素的进一步研究奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
氢氧化钠、石油醚、乙酸乙酯、乙醚、无水乙醇、甲醇、丙酮、盐酸等：均为分析纯；落葵果实干种子：河北大学质量技术监督学院实验室提供；菌种：金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)，河北大学质量技术监督学院微生物实验室提供。
1.2 仪器与设备
多功能搅拌机 苏泊尔股份有限公司；V-1100D型可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；PTX-FA210S型电子天平 福州华志科学仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；摩尔元素机 重庆摩尔水处理设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 落葵种子色素的提取
1.3.1.1 最佳提取溶剂的确定
选择纯水；有机溶剂：石油醚、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇。无水乙醇体积分数分别为95%,80%,70%,50%,20%。各取20 mL作为提取剂，分别加入0.5 g粉碎的落葵种子，充分摇匀后，浸提1 h，观察颜色。取落葵色素溶液稀释后，以纯水为参比液，用可见光分光光度计在波长400～600 nm 的范围内以20 nm为间隔扫描，测定吸光度，通过比较最大吸光度得到落葵种子色素吸收的最适波长。以纯水代替溶剂作空白对照, 根据吸光度大小确定最佳提取溶剂。重复3次，取平均值。
1.3.1.2 最佳提取温度和时间的确定
准确称量2 g落葵种子试样于12个100 mL容量瓶中，用纯水定容。平均分为4组，1组在室温放置，另外3组分别在恒温40,60,75 ℃的水浴锅中加热，每组容量瓶分别在浸提20,30,60 min后取出。待溶液冷却至室温后，用分光光度计以蒸馏水作为空白对照，在最适波长下测定吸光值，比较最大吸光值，确定最佳提取温度与时间。重复3次，取平均值。
1.3.1.3 最佳提取pH值的确定
最佳提取条件下取得的色素溶液各1.0 mL分别加入8支比色管中，用盐酸溶液与氢氧化钠溶液配制pH值梯度在2.0～9.0的酸碱度不同的溶液，分别加入8支比色管中定容至50.0 mL，观察试管中溶液颜色，并测定在最佳波长下的吸光度，以确定其最佳pH值。重复3次，取平均值。
1.3.1.4 最佳提取液料比的确定
准确称取1.0 g落葵种子试样5份，分别加入12,16,18,20,24 mL的蒸馏水，浸提30 min，以8000 r/min离心12 min，取相同体积上层清液于比色管中，以蒸馏水为空白对照，测定不同条件提取的溶液在最适波长下的吸光度，确定最佳液料比。重复3次，取平均值。
1.3.1.5 最佳提取次数的确定
在最佳浸提条件下浸提0.5 g种子样品，浸提至无色，分别收集每次色素溶液，测定其体积和吸光度。计算浸提率，确定最佳提取次数。
1.3.1.6 最佳浓缩干燥条件的选择
取等量落葵色素提取液于锥形瓶中，分成2组，一组置于水浴锅中在40 ℃蒸发干燥，另一组于室温干燥。称量并记录锥形瓶干燥后的重量，比较2种条件下的干燥效果。
1.3.2 落葵果实色素正交实验
确定最佳提取液为水，1∶18为最佳液料比为固定条件，以温度、提取时间和pH值为3个因素并拟定3个程度，设计L9(34)正交实验，进行提取实验，将提取液稀释定容至相同体积，在最适波长540 nm下测定各自的吸光度，确定最佳提取条件。正交实验设计表见表1。
表1 正交实验设计表Table 1 Orthogonal experiment designTable
1.3.3 落葵果实色素溶液的制备
称量0.5 g粉碎的落葵果实试样，加入8 mL无菌水，浸取30 min后，以10000 r/min离心10 min，取上层清液，用无菌水配成50%,10%,1% 3种不同浓度的落葵果实色素溶液备用。
1.3.4 落葵果实色素提取液的抑菌试验
用灭菌的牛肉膏-蛋白胨液体培养基分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌在37 ℃，24 h进行增菌，菌液浓度为106个/mL。采用灭菌的琼脂培养基制成平板，分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌2种菌悬液各0.2 mL制成菌平板，每个平板放3片浸有不同浓度样品的滤纸片做平行样品，并设阴性对照(无菌)在37 ℃，24 h培养，观察抑菌圈大小。
2 结果与讨论
2.1 落葵果实色素单因素实验
2.1.1 最佳提取溶剂的确定
表2 不同浸提液效果Table 2 Different extract's effects
由表2可知，呈现紫红色的纯水浸提液浸提效果最好，浸提液呈现淡黄色的有机溶剂的提取效果较差，乙醇溶液随着浓度增加，浸提效率逐渐降低；根据相似相溶的性质，落葵红色素为水溶性色素。确定水是最佳提取液，相较而言水的成本低，符合实际生产工艺的要求。
2.1.2 最佳提取温度和时间的确定
表3 不同温度和时间浸提液效果比较Table 3 Comparison of extract's effects at different temperatures and time
由表3可知，温度对色素的稳定性影响较大，室温下随着提取时间的加长，色素的提取效果逐步提升，而高温下，随着时间的加长，色素提取效果下降。结合实际生产降低成本、减少流程步骤的需要，故选择最佳提取温度为室温，提取时间为30 min。
2.1.3 最佳提取pH值的确定
表4 不同pH值浸提液效果比较Table 4 Comparison of extract's effects of different pH values
由表4可知，色素在酸性环境下吸光度较大，吸光值在pH 4～6之间达到峰值，综合工业需求，考虑选择pH 5为最佳提取条件，同时在浸提工艺中可以加入盐酸或者醋酸为pH调节剂，增加色素稳定性。
2.1.4 最佳提取液料比的确定
表5 不同液料比浸提液效果比较Table 5 Comparison of extract's effects of different liquid-material ratios
由表5可知，液料比越大，提取效果越好；在液料比1∶18之后，提取效果基本稳定，提取率变化幅度小。综合考虑实际生产经济和后续浓缩的需要，选择1∶18为最佳提取液料比。
2.1.5 最佳提取次数的确定
表6 不同浸提次数浸提液效果比较Table 6 Comparison of extract's effects of different extraction times
由表6可知，浸提次数越多，提取率越大。提取3次后，提取率增加不明显，出于成本考虑，确定最佳提取次数为3次。
2.1.6 最佳浓缩干燥条件的选择
表7 不同干燥条件比较Table 7 Comparison of different drying conditions
由表7可知，水浴蒸干用时短，色素得率高。自然干燥不仅耗时长，且易引起色素变质，因此确定最佳干燥条件为水浴蒸干。
2.2 落葵果实色素正交实验
表8 正交实验方案及结果Table 8 Orthogonal experimental scheme and results
由表8可知，根据极差 R 值，不同水平因素对色素提取率影响的主次顺序为 A>C>B，温度为主要影响因素，由此确立最佳提取工艺为 A1B1C1，A1B2C2，综合考虑，选择提取温度 25 ℃、pH值5、时间30 min 为最适条件。
2.3 落葵果实色素抑菌实验
采用卡尺测量抑菌圈直径的方法对落葵果实色素的抑菌性进行了研究。结果显示：在含有浸泡原液、50%浓度、10%浓度、1%浓度滤纸片的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的含菌平板上均无明显抑菌圈，初步判断落葵果实色素无抑菌作用。
3 讨论
本文对落葵种子色素提取条件的优化做了初步探讨。落葵种子色素的提取条件为：将原料清洗后，烘干，粉碎；以纯水为提取剂，在pH 4～6条件下用1∶18的液料比，将原料于常温下浸提 3 次，每次30 min，浸提液可以经高速离心后过滤或直接过滤后，用恒温水浴蒸干，色素在高温下易变质，水浴温度宜控制在40 ℃以下。本文得出的落葵种子色素提取的最适吸收波长、最佳提取液、最适pH值、最适提取温度等提取条件与目前所存文献基本一致。在判断指标上，张美荣等采用色价为比较项目，更加便于判断色素的品质。与以往文献相比，本研究结果更加确切，pH的范围进一步缩小，为生产提供了可靠依据。本文对落葵种子色素的抑菌性做了探究，进一步拓宽了对落葵种子色素性质的了解；较为全面地探究了落葵种子色素的提取条件，为落葵种子色素进一步开发利用奠定了基础。
