间充质干细胞在骨髓造血微环境对造血的调控作用及其研究进展

周倍伊

（广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200）

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓内多潜能基质细胞，可以分化为成骨、软骨、脂肪、成肌和神经胶质等多种成体细胞。造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新的能力以及分化成各类成熟血细胞的能力。1978年Schofield［1］首次提出骨髓造血微环境“Niche”的概念，他发现Niche参与HSC的维持、自我更新和多向分化的调控。之后，人们从骨髓鉴定到多个HSC体外扩增所必需的生长因子，如干细胞因子（SCF）、促血小板生成素（TPO）等［2-3］，进一步印证了骨髓造血微环境的存在。国内外临床及实验研究证明，骨髓间充质干细胞是骨髓造血微环境重要的构成细胞之一，临床研究发现，间充质干细胞（MSCs）与HSC共移植能加快恢复造血微环境的造血重建［4-5］，体外MSCs与HSC共培养实验显示，两种细胞共培养能促进HSC增殖［6］，证明MSCs在骨髓造血微环境中对造血调控的重要作用。本文就间充质干细胞在骨髓造血微环境中对造血的影响综述如下。

1 骨髓间充质干细胞的培养及生物学特征

1.1 骨髓间充质干细胞的分离、纯化及培养 目前常用分离、纯化及培养MSCs的方法主要有免疫磁珠法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和全骨髓贴壁培养法［7-8］。免疫磁珠及流式细胞仪两种方法虽然可以分离获得高纯度的MSCs，但筛选出来的MSCs出现了活性低、增殖慢、贴壁性差等现象［9-10］。密度梯度离心法则是根据MSCs与骨髓中其他细胞密度不同进行梯度分离［11］。但是经密度梯度法获得的MSCs数量少，原代培养首次细胞融合时间长。相比前述3种方法，全骨髓贴壁培养是利用MSCs能在培养皿中贴壁生长的特性，经过多次换液除去不贴壁细胞而达到细胞纯化的目的，从而进行传代培养。全骨髓贴壁培养法简便有效，其分离的细胞活性高，增殖快，是实验室目前应用最多的MSCs培养方法［12］。

1.2 骨髓间充质干细胞形态及生物性特征 接种于培养瓶中的细胞呈圆型，24 h后部分细胞开始贴壁，呈圆形、梭形或多角形。24 h换液后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长，3～4 d可见放射状排列的细胞集落，以梭形细胞为主，核仁清晰。6～7 d细胞呈集落生长，融合率达80%～90%，呈漩涡状时可传代培养。第3代大鼠MSCs流式细胞仪表面标志物检测显示，BMSCs均表达CD105、CD90、CD44，而CD34、CD45呈阴性［13-14］。

2 骨髓造血微环境的构成细胞

目前骨髓造血微环境的构成细胞研究最多的有三种：成骨细胞、内皮细胞和骨髓间充质干细胞。

2.1 成骨细胞 成骨细胞是骨内膜造血微环境的关键组成部分之一，HSC围绕着成骨细胞排列在骨内膜附近，骨内膜造血微环境为成骨细胞和HSC之间的相互作用提供了场所。骨内膜造血微环境中的成骨细胞来源于多潜能的MSCs，在HSC的增殖分化和静止中MSCs起重要作用［15］。 Calvi等［16］和 Zhang等［17］的研究分别证明骨髓内的成骨细胞亚群是HSC造血微环境的关键细胞组分，提高成骨细胞的数量能够促进HSC的自我更新和造血活动。

2.2 内皮细胞 内皮细胞在保持HSC干性及增殖上起着重要作用。内皮细胞通过分泌细胞因子使体内未成熟的造血细胞增加，在骨髓外维持着HSC功能［18］。Winkler等［19］发现内皮细胞特异性细胞黏附分子E-选择素能够促进HSC的体内增殖，证实内皮细胞对HSC具有促增殖作用。Heissig等［20］发现敲除内皮细胞上的Kit配体基因会导致HSC的减少，也证明了内皮细胞对HSC维持的重要意义。

2.3 间充质干细胞 MSCs可以分化为成骨细胞，MSCs在骨髓造血微环境起着重要作用已经得到证实。Méndez-Ferrer等［21］研究发现骨髓造血微环境是由MSCs与HSC共同组成的一个独特的造血龛（Niche），Niche调控骨髓造血微环境的造血功能。在临床上，将MSCs与HSC共移植可促进移植后白血病患者的造血重建，机体造血功能恢复加快［22-23］。所以，无论是临床观察还是实验研究都证明MSCs是骨髓造血微环境重要的构成细胞。

3 骨髓间充质干细胞对骨髓造血微环境的造血调控

3.1 骨髓间充质干细胞对骨髓造血微环境中造血干细胞的影响 MSCs与HSC共培养实验发现，MSCs与HSC接触共培养，HSC的增殖能力比HSC单独培养、MSCs与HSC非接触共培养增殖能力更强［6］。Méndez-Ferrer［21］等也发现骨髓造血微环境内MSCs数量的增加则促进HSC数量的增加。徐志娟等［24］用来源于脐血的造血干细胞与间充质干细胞共培养14 d，发现与间充质干细胞共培养的造血干细胞增殖率明显高于单独培养的造血干细胞（P＜0.05）。杜幸军等［25］利用人胎盘来源的间充质干细胞联合人外周血造血干细胞共移植，植入严重联合免疫缺陷小鼠体内，观察对小鼠早期造血的影响，发现人胎盘来源的间充质干细胞可以促进人外周血造血干细胞的植入，缩短造血干细胞移植后造血恢复时间。王金福等［26］的临床研究显示，MSCs与HSC共移植增加了HSC的量，他们推测其原因可能与骨髓间充质干细胞所创造的复杂造血微环境有关。

3.2 骨髓间充质干细胞分泌的细胞因子对骨髓造血微环境造血干细胞的作用 MSCs与HSC直接接触可分泌黏附因子，加快HSC归巢。MSCs分泌黏附因子如血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）以及基质细胞衍生因子-1（SDF-1），介导HSC归巢，促使HSC穿过血管进入骨髓［27］。Bernardo 等［28］发现 MSCs还能产生大量的细胞外基质分子，如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等，介导HSC与骨髓基质的黏附，使归巢的HSC稳定黏附于骨髓造血微环境。体外培养MSCs能分泌大量细胞因子，如白细胞介素-3（IL-3）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF）、促血小板生成素（TPO）等，可以解决机体细胞因子相对不足的问题［29］。静脉输注HSC后，HSC沿干细胞因子（SCF）浓度梯度迁移到骨髓，并与表达SCF的骨髓基质细胞黏附结合，以此加速HSC的归巢，开启HSC细胞周期进程。Walenda 等［30］发现MSCs与 SCF、TPO、成纤维细胞生长因-1（FGF-1）联合应用能显著增强MSCs造血支持作用。

3.3 调控骨髓间充质干细胞的信号通路对骨髓造血微环境造血的影响 Notch基因编码是一类高度保守的细胞表面受体，它们调节多种生物细胞的发育，Notch信号在正常发育过程中发挥重要的角色，能够显著增强细胞增殖水平，通过抑制JunB蛋白调节抑制BMP9诱导的MSCs成骨分化［31］。临床研究发现，造血微环境信号通路对化疗后的造血重建具有积极的调控作用，其机制可能是Notch信号通路激活骨髓间充质干细胞的PI3K增殖信号通路，从而加速细胞周期的进程［32］；趋化因子受体CXCR4与其主要配体CXCL12的CXCL12／CXCR4信号通路对骨髓造血微环境中造血干祖细胞的保留和迁移起着至关重要的作用。异位的CXCR4可促进间充质细胞CXCL12配体依赖性信号转导在进行脐血来源的造血干细胞移植后增加造血祖细胞存活和增殖能力［33］；由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合的Wnt信号通路（Wnt／β-catenin）是经典的信号通路，其调控许多重要的细胞功能，如干细胞增殖和维持。骨髓间充质干细胞可以分化为成骨细胞，Wnt信号通路的激活可以促进成骨细胞的骨合成代谢作用，提高成骨细胞的Jagged 1的表达，可促进HSC的自我更新和增殖［34-35］；Tie2／Ang-1信号通路是HSC和骨髓造血微环境内细胞之间作用的关键信号通路。HSC在骨表面的定位受成骨细胞特异性黏附分子如N-钙黏蛋白的调节，一旦HSC与成骨细胞相邻定位，成骨细胞会产生Ang-1并激活HSC上的Tie2，促进HSC在骨髓中的紧密黏附，从而使HSC处于静止状态，可自主保护骨髓造血干细胞和祖细胞免受损伤，还可增强造血重建［36-37］。有研究显示骨髓造血微环境的信号调控存在整合，如Wnt信号通路与Notch信号通路协同调控HSC的功能［38］，周倍伊等［39-40］研究发现复方扶芳藤合剂可以促进大鼠MSCs增殖，增加小鼠外周血HSC，其机制可能是通过激活Notch、Wnt两条信号通路产生协同调控的结果。

4 讨论和展望

造血干细胞在体内的增殖分化、干性维持等生理活动受其周围环境的影响，骨髓造血微环境是HSC赖以生存的微环境。作为研究最多的构成细胞MSCs对骨髓造血微环境造血产生的重要影响已经得到证实，MSCs与HSC在骨髓造血微环境中通过细胞接触产生多种细胞因子，以及在造血微环境内调节MSCs的多个信号通路，从而调节HSC的功能，维持其生物特性的相对稳定。随着对造血微环境研究的深入，我们对于造血微环境中的构成细胞及信号作用机制也有了进一步的认识，但这些信号通路之间是如何整合调控HSC的机制尚不清楚，在今后的研究中，应进一步阐明机制，有助于在体外培养、扩增HSC，从而将HSC广泛用于再生医学。