白念珠菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白Ppt2的制备

孟玲宁 刘锦燕 赵悦 王钰婷1， 项明洁

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

条件致病性真菌在过去的几十年中逐渐被视为人类真菌感染的重要致病菌，尤其在免疫功能低下的患者，如移植受者、艾滋病患者和癌症患者，由念珠菌属引起的侵袭性感染是现代血流感染的第4大死因[1]。目前可用的抗真菌药物为多烯类、唑类、烯丙胺类、棘白菌素类和嘧啶类，一方面这些药物会对患者胃肠道产生一定的副作用[2]，另一方面临床上预防性抗真菌感染治疗增加、抗真菌药物广泛和不合理的使用，导致敏感菌株被抑制或杀灭，耐药菌株逐渐被诱导产生并大量繁殖，使真菌的耐药率越来越高，尤其医源性感染交叉感染的耐药菌检出率远高于平均水平[3]。因此迫切需要研发基于新作用靶点的抗真菌药物，避免这些已知耐药机制的作用。

既往研究发现在白念珠菌中辅酶A将磷酸泛酰巯基乙胺基转移给无活性的载体蛋白形成具有活性的全蛋白过程中，需要一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Ppt2的催化作用。该酶在生物代谢过程中发挥重要作用，同时此型别是真菌所特异的，不存在于哺乳动物中，使其成为一个理想的抗真菌药物新靶点[4]。本次实验中我们通过同源重组以及原核表达技术成功制备了磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Ppt2，并利用Ppt2蛋白的His标签对其进行纯化，最终获得较高纯度的目的蛋白Ppt2，为后期荧光偏振法筛选靶点为Ppt2酶的临床药物打下基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与材料

白念珠菌BWP17由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室馈赠；质粒pET43.1a(+)、大肠杆菌BL21(DE3)购自生物风生物公司；DMT感受态细胞购自北京华越洋生物科技有限公司;pyrobest酶(TaKaRa公司);氨苄西林(碧云天); SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、IPTG (生工生物工程有限公司);一步法定向克隆无缝克隆试剂盒 (南京诺唯赞生物科技有限公司); PCR产物回收试剂盒 (Biomiga公司)。

1.2 引物设计与合成

白念珠菌PPT2基因ORF全长为408bp，根据白念珠菌基因组数据库中的基因序列设计1对PPT2基因特异性引物。上游引物PPT2-F为5’-GACGACGACAAGATGCCAAAAGTAGGCACTGTAT-3’；下游引物PPT2-R为5’-AGCTCCCGGACTTTAGATTTGATAAACCTTCT-3’(下划线处分别是与线性化质粒片段互补的部分)。用于线性化质粒的上游引物pET43.1-F为5’-CTTGTCGTCGTC-3’;下游引物pET43.1-R为5’- AGTCCGGGAGCT-3’。引物由生工生物工程有限公司合成。

1.3 PCR扩增PPT2基因和线性化质粒pET43.1

以白念珠菌BWP17为模板，PPT2-F和PPT2-R为引物扩增白念珠菌PPT2基因。体系(50 μL)为0.25 μL pyrobest酶;5 μL 10×buffer II;4 μL dNTP mix(2.5 mol/L);引物(10 μmol/L)各1 μL;模板100 ng。PCR反应条件为94℃ 1 min预变性;98℃ 5s,55℃ 45s,72℃ 1 min,共25个循环。以质粒pET43.1为模板，pET43.1-F和pET43.1-R为引物线性化扩增pET43.1片段，反应体系同上。反应条件为94℃ 1 min预变性;98℃ 5s,55℃ 45s,72℃ 8 min,共30个循环。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.4 重组表达载体的构建及鉴定

利用PCR产物回收试剂盒对PPT2基因和pET43.1片段进行回收纯化。取纯化后的产物于冰水浴中配制反应体系(20 μL)，其中线性化克隆载体pET43.1为50～200 ng；插入片段扩增产物为20～200 ng；ExnaseTMII为2 μL；5×CE II buffer为4 μL。体系配制完成后置于37℃反应30 min，然后冰水浴中冷却5 min，将冷却反应液加入到200 μL感受态细胞DMT中，混匀后在冰上放置30 min，42℃热击90秒，冰水浴孵育2 min，加入900 μL LB培养液后 37℃摇菌45 min，取100 μL菌液均匀涂布在含有适当氨苄西林的LB平板上于37℃过夜培养。挑取阳性单克隆菌落利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒DNA的抽提，质粒DNA产物送铂尚生物技术有限公司进行测序。测序正确后将重组表达质粒pET43.1a(+)/PPT2转化入感受态细胞大肠埃希菌BL21(DE3)，利用含氨苄西林抗性平板筛选阳性克隆。

1.5 诱导表达重组蛋白Ppt2

挑取pET43.1a(+)/PPT2阳性克隆菌株于含有氨苄西林的2 mL LB培养液中37℃ 200 r/min摇菌16 h，将过夜培养物以1∶50稀释转种于含氨苄西林的LB培养液中继续以37℃ 200 r/min摇菌。当菌液OD600=0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L诱导过夜。4℃ 8 000 g离心10 min收集沉淀，保存于-80℃。

1.6 重组蛋白的抽提

沉淀菌体用10倍重量体积的PBS悬浮，冰浴条件下400 W，工作4s，间歇6s超声直至破菌液不粘稠。12 000 r/min离心30 min，分别收集上清液和沉淀。SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性情况。

1.7 重组蛋白的纯化

利用重组蛋白上的HIS标签对其进行纯化。首先Ni柱清洗后用平衡液(20 mmol/L PB, 500 mmol/L NaCl, pH7.4)平衡3～5个柱体积；蛋白抽提上清液进行上样后收集柱流出组分；再用含50 mmol/L咪唑缓冲液(20 mmol/L PB, 500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L 咪唑，pH7.4)洗涤，去除结合能力较弱的杂蛋白和核酸的杂质；最后分别用含100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 咪唑缓冲液洗脱目标蛋白，收集洗脱峰。再利用AKTA 层析系统对上述100 mmol/L咪唑洗脱的组分进行进一步的纯化。首先系统和柱子清洗后用Buffer A(20 mmol/L PB, 200 mmol/L NaCl, pH7.4)平衡，将100 mmol/L咪唑洗脱的组分上样后收集流出组分，再分别用含有100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L和500 mmol/L不同咪唑浓度梯度的Buffer B洗脱液(20 mmol/L PB, 200 mmol/L NaCl, 相应浓度咪唑, pH7.4)洗脱并收集洗脱峰。取样后进行SDS-PAGE纯度分析并通过Western-blot进行验证。

1.8 重组蛋白的透析

取截留分子量为1万的透析袋装入含目的蛋白的洗脱液，在10倍体积的外透液(PBS，pH=7.4)条件下4℃搅拌透析过夜，后取截留分子量3万的离心浓缩管，4 000 r/min 4℃离心浓缩至需要的体积。最后利用Bradford法测定所获得蛋白Ppt2浓度。

2 结 果

2.1 PPT2片段和线性化质粒pET43.1 PCR产物鉴定

以BWP17为模板，PPT2-F/R为引物扩增白念珠菌PPT2基因全长，扩增产物片段大小为408 bp，电泳结果如图1所示。将PCR产物回收后送生工生物工程有限公司进行测序，测序结果与白念珠菌SC5314的PPT2基因序列对比，没有发生点突变。以质粒pET43.1为模板，pET43.1-F/R为引物对质粒进行线性化扩增，扩增产物片段大小应为7275 bp,电泳结果如图2所示。

图1PPT2片段PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳分析图2线性化质粒pET43.1 PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳分析

Fig.1Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplification of PPT2 fragmentFig.2Agarose gel electrophoresis analysis of linearized plasmid pET43.1 by PCR amplification

2.2 表达产物Ppt2蛋白抽提鉴定

0.1 mmol/L IPTG过夜诱导的结果如图3所示，通过对超声裂解液进行SDS-PAGE电泳，可见IPTG诱导后的蛋白表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中(泳道D)，分子量与预计大小一致为76 kD；只有少部分以可溶性蛋白的形式存在于上清中(泳道C)。后期放大摇菌量集菌后蛋白抽提结果如图4所示，超声裂解液的上清中存在大量的可溶性蛋白Ppt2，故收集上清中的可溶性蛋白进行后续的挂柱纯化，富集可溶性蛋白Ppt2。

图3表达产物Ppt2蛋白抽提的SDS-PAGE分析. 注：B1-3:诱导细胞裂解液；A:未诱导细胞裂解液；B:诱导细胞裂解液；C:诱导细胞裂解液上清；D:诱导细胞裂解液沉淀；MK:蛋白质分子量图4放大摇菌量集菌后蛋白抽提的SDS-PAGE分析

Fig.3SDS-PAGE analysis of protein extraction of Ppt2. Lane B1-3: Induced cell lysate; Lane A: Non-induced cell lysate; Lane B: Induced cell lysate; Lane C: Supernatant of cell lysate； Lane D: Precipitation of cell lysate； MK: Molecular weight markerFig.4SDS-PAGE analysis of protein extraction after amplifying the bacteria. Lane A: Non-induced cell lysate Lane； B: Whole induced cell lysate； Lane C: Supernatant of cell lysate Lane； D: Precipitation of cell lysate； MK: Molecular weight marker

2.3 Ppt2蛋白纯化结果鉴定

首先通过Ni柱纯化后的目的蛋白SDS-PAGE以及Western blot结果如图5所示，可见洗脱液浓度为50 mmol/L咪唑和100 mmol/L咪唑时，能够富集到目的蛋白Ppt2，但是验证到蛋白存在部分降解。因此收集100 mmol/L咪唑洗脱馏分进行下一步akta-HIS柱纯化提高目的蛋白纯度，结果显示大部分目的蛋白Ppt2存在于流穿液中，故收集流穿液馏分透析浓缩后作为最终产物。最后通过Bradford法测得蛋白浓度为0.4 mg/mL，蛋白产物为0.4 mg/mL×5.5 mL=2.2 mg(见图6)。

图5Ni柱纯化后的目的蛋白SDS-PAGE以及Western blot结果。注：P:阳性对照;N:阴性对照;A:裂解液上清样品；B:流穿液；C-G：不同浓度咪唑洗脱液(20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L)；MK:蛋白质分子量图6akta-His柱纯化后的目的蛋白SDS-PAGE结果。注：A:100 mmol/L咪唑洗脱液；B:流穿液；1-9:不同浓度咪唑洗脱液；MK:蛋白质分子量

Fig.5SDS-PAGE and Western blot results of the target protein after purification on Ni columnFig.6SDS-PAGE results of target protein after purification on akta-His column

3 讨 论

白念珠菌是临床最常见的条件致病性真菌，近年来，其感染率和耐药率均不断上升，给临床治疗白念珠菌感染带来巨大的挑战。因此基于真菌新作用靶点的药物研发是迫切需要的。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases，PPTases)存在于细菌、真菌以及哺乳动物中，其在生物代谢过程中发挥着重要作用[5]。辅酶A将磷酸泛酰巯基乙胺基转移给无活性的载体蛋白后形成具有活性的全蛋白，从而发挥作用，在此过程中需要PPTases的催化作用。在真菌中，PPTases分为三种型别，第1种“结构域”型,参与细胞质中脂肪酸的合成；第2种为Sfp型(酿酒酵母和白念珠菌中为Lys5，在烟曲霉菌中为PptA)，参与赖氨酸的生物合成，激活α-氨基乙氨酸还原酶参与聚酮化合物和非核糖体肽合成酶复合物的合成[6]；第三种为AcpS型(在酿酒酵母和白念珠菌中为Ppt2，在烟曲霉菌中为PptA),参与线粒体中脂肪酸的合成，将辅酶A中的磷酸泛酰巯基乙胺基转移给线粒体中的酰基载体蛋白Acp1,使其具有活性后成为线粒体中硫辛酸合成的辅因子，硫辛酸是线粒体中的辅酶，对于真菌线粒体呼吸作用非常重要。

细菌中的PPTase大多为Sfp型，此前有研究发现2-吡啶基-N-(4-芳基)-哌嗪-1-硫代甲酰胺表现出对细菌Sfp-PPT的亚微摩尔级的抑制作用，而其类似物中4-(3-氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-)-N-(4-甲氧基吡啶-2-)哌嗪-1-硫代甲酰胺(ML267)具有更强的对微生物PPT2的抑制作用和选择性。然而，目前国内外对于真菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的研究比较少，且大多数聚焦在PPTase的功能学研究等方面，并没有进行更加深入的临床相关研究[7]。Dobb等[4]发现抑制PPT2基因表达的白念珠菌在SD培养基上无法生长。此外,AcpS型别的PPTases还是真菌所特有的，哺乳动物中均为Sfp型，使其成为一个非常有潜力的抗真菌药物的靶点。所以本次研究通过制备白念珠菌Ppt2蛋白，为后续荧光偏振筛选药物提供条件，最终能够为临床治疗白念珠菌感染提供新的思路。

在本次研究目的蛋白抽提过程中，Ppt2主要以包涵体的形式存在于裂解液沉淀中，只有少部分可溶性蛋白存在于上清液中，但考虑到包涵体蛋白后期纯化过程涉及到复性等较复杂的操作[8]，故本次实验采用扩大摇菌量获取上清液中的可溶性蛋白进行进一步纯化。在目的蛋白纯化过程中，第1步Ni柱纯化时蛋白Ppt2有一部分存在于流穿液中，而不同浓度洗脱液中100 mmol/L咪唑洗脱组分中除去目的蛋白外杂带最少，所以选取100 mmol/L咪唑洗脱液进行下一步纯化；在akta-His柱纯化过程中，目的蛋白有部分存在于流穿液中，咪唑洗脱的各部分也有目的蛋白，但是流穿液中组分纯度最好，故收集流穿液进行透析和浓缩，目的蛋白Pp2出现在流穿液中，可能是因为蛋白Ppt2跟Ni柱结合不紧密，这跟蛋白本身结构有关。

综上所述,我们通过原核表达技术成功制备了白念珠菌Ppt2重组蛋白,蛋白纯化步骤简便且得率较高,为日后利用靶酶Ppt2进行高通量的荧光偏振法药物筛选打下了基础。