日舒安洗液联合克霉唑治疗小鼠外阴阴道念珠菌病的疗效观察

刘道凡 伍启康

(1.广东省佛山市第一人民医院皮肤科，佛山 528000；2. 广东省佛山市第一人民医院检验科，佛山 528000)

阴道念珠菌病是常见的妇科疾病之一，是由假丝酵母菌感染引起的炎症[1]，主要临床表现为白带异常、外阴水肿、红斑伴瘙痒、灼烧感等，在患者的阴道灌洗液中细胞因子水平也会出现变化[2-3]。日舒安洗液是由20多种中药提取得到的外用中药制剂，主要成分苦参，具有杀虫止痒、清热燥湿等功效，可用于治疗多种类型阴道炎以及其他妇科疾病。临床实验结果表明，日舒安洗液治疗阴道炎疗效明显[4]。克霉唑是广谱抗真菌药物，可以通过抑制真菌细胞膜的合成抑制真菌的生长，研究表明克霉唑可有效地抑制念珠菌病[5]。目前治疗念珠菌性阴道炎多采用单药治疗，长期治疗症状易反复，疗效欠佳，给患者精神和身体带来较大痛苦。因此找到有效的治疗手段能够抑制念珠菌、进而缓解并治愈念珠菌性阴道炎是临床亟待解决的问题之一。本次研究以BALB/c雌鼠为疾病研究模型，观察日舒安洗液联合氟康唑对外阴阴道念珠菌病的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

日舒安洗液由贵州汉方药业有限公司生产；克霉唑片由乐普药业股份有限公司生产；IL12、IL10和IL6的ELISA试剂盒(南京森贝伽生物有限公司)；Trizol试剂盒(invitrogen公司)；逆转录试剂盒Fermentas:K1622(Thermo Scientific)；SYBR Green试剂盒(QIAGEN公司)。

菌悬液的制备 将新传代的白念珠菌14053接种于YDP液体培养基上，30℃，200 r/min培养18 h，用细胞计数仪进行计数，调节白念珠菌孢子浓度为3×106CFU/mL。

实验动物 BALB/c雌鼠(成都达硕实验动物有限公司，鼠龄8周)。

仪器 ABI-Veriti型普通PCR仪(美国Applied Biosystems)；美国ABI 荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)。

1.2 方法

实验分组 将95只BALB/c雌鼠随机分为4组，A组5只为空白对照组, B组30只为模型对照组, C组30只为克霉唑治疗组(克霉唑每天阴道内使用1.5 mg/L 100 μL),D组30只为日舒安洗液联合克霉唑治疗组(日舒安洗液稀释10倍，反复冲洗阴道，1次/d，克霉唑每天阴道内使用1.5 mg/L 100 μL)。除了空白对照组外其他组都要先建立外阴阴道念珠菌病模型。

念珠菌病小鼠疾病模型建立[6]首先将B组，C和D组每只小鼠皮下注射1 mg/mL苯甲酸雌二醇油剂0.1 mL，每隔1 d注射1次，共注射3次。第6天后，用无菌水对小鼠阴道进行灌洗，对灌洗液进行观察是否有小鼠阴道上皮细胞，若有上皮细胞，将准备好的白念珠菌菌液(3×106CFU/mL)接种小鼠阴道内，每只10 μL，接种后将小鼠倒立3 min以防止菌液流出，使用同样的操作方法持续接种3 d。

药物治疗 在念珠菌病小鼠疾病模型建立成功1d后，对小鼠进行治疗。A组和B组每天予等量的生理盐水冲洗阴道，C组每天只用克霉唑阴道内使用1.5 mg/L 100 μL进行治疗, 对D组小鼠用稀释10倍的日舒安洗液，反复冲洗阴道，每日1次，并同时联合克霉唑每天阴道内使用1.5 mg/L 100 μL进行治疗。

1.3 疗效评价

在治疗后的第8天取各组小鼠阴道灌洗液进行菌落培养，采用涂布法检测小鼠的阴道真菌载荷量，并通过ELISA检测IL-2和IL-8的水平；qRT-PCR法检测小鼠阴道组织中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS11.0软件进行统计学分析，多组间比较用方差分析，两组间比较用 LSD-t 检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠体重变化

在前8天4组小鼠的体重均保持稳定，接种后B、C和D组小鼠体重下降，随后体重逐渐上升，接近接种前水平。A、B、C和D组4组小鼠之间体重未出现统计学差异(P>0.05)，如图1所示。

图1 小鼠体重变化图

2.2 各组小鼠阴道灌洗液真菌载量

通过涂布法检测小鼠的阴道真菌载荷量，A组小鼠阴道真菌载荷均为阴性，B组、C组和D组检测结果如表1-3所示。在治疗后的第1、2、3、6、8、10和14天，B组和C组，C组和D组小鼠阴道灌洗液培养真菌载荷量均具有统计学差异，P均小于0.01。C组和D组小鼠阴道灌洗液培养，治疗后第2天较第1天明显降低，但第3天增高，随后C组和D组小鼠阴道真菌载荷量均逐渐降低，但D组小鼠阴道真菌载荷量小于C组小鼠，两组之间CFU差异有显著性(P值均<0.01)。D 组小鼠治疗后第3天有2例转阴，感染后第8天有3例转阴,14 d后有6例转阴，C组小鼠只在14 d后有1例转阴，B组小鼠未见转阴标本。

表1 3组小鼠阴道灌洗液真菌载量(CFU/mL)

表2 B、C两组小鼠阴道灌洗液真菌载量(CFU/mL)

表3 D、C两组小鼠阴道灌洗液真菌载量(CFU/mL)

2.3 各组小鼠IL-2和IL-8检测结果

使用ELISA试剂盒检测各组小鼠IL-2和IL-8水平，A组小鼠IL-2的均值为(86.42±6.32) pg/mL，IL-8的均值为(88.21±19.68) pg/mL。检测B组、C组和D组小鼠在治疗前后的IL-2和IL-8表达水平，结果如图2、3所示，D组和C组小鼠分别经日舒安洗液联合克霉唑治疗和单用克霉唑治疗后阴道分泌物中IL-2和IL-8的表达水平明显下降，D组的表达水平低于C组和B组，C组小鼠的表达水平低于B组，组间相比具有统计学差异(P值均<0.01)。说明日舒安洗液联合克霉唑治疗小鼠外阴阴道念珠菌病效果显著，效果比单用克霉唑治疗好。

图2 3组小鼠IL-2表达水平

图3 3组小鼠IL-8表达水平

2.4 各组小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达检测

与正常组A组比较，模型组B组的NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达分别上调了5.82、3.16和4.58倍，用日舒安洗液联合克霉唑治疗过的小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达分别上调了2.20、2.22和2.88倍，单用克霉唑治疗过的小鼠NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达分别上调了3.78、2.62和3.56倍，见图4-6。B组和C组,C组和D组相比NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达具有统计学差异(P值均<0.01)，说明日舒安洗液联合克霉唑和单用克霉唑治疗后小鼠NLRP3炎症小体激活被抑制，但日舒安洗液联合克霉唑的效果更好。

3 讨 论

本文研究观察了日舒安洗液联合克霉唑对小鼠外阴阴道念珠菌病的治疗作用效果，通过检测小鼠阴道灌洗液真菌载量、IL-2和IL-8的表达及NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达来检测其治疗作用。

图4各组小鼠NLRP3 mRNA表达检测图5各组小鼠ASC mRNA表达检测图6各组小鼠caspase-1 mRNA表达检测

Fig.4Detection of NLRP3 mRNA expression in miceFig.5Detection of ASC mRNA expression in miceFig.6Detection of caspase-1 mRNA expression in mice

本次研究中，日舒安洗液联合克霉唑治疗小鼠后小鼠阴道灌洗液真菌载量明显降低，低于单用克霉唑治疗组。在外阴阴道念珠菌病患者的阴道灌洗液中细胞因子的水平会出现明显的升高，如IL-2和IL-8，两者是炎性反应中较为重要的炎性因子，可参与炎症的发生和发展。IL-2是T细胞分泌的细胞因子，可通过自分泌活化T细胞 ，调控炎症、自身免疫病、心血管等疾病进展。IL-8是白介素家族成员，同时也是趋化因子之一，在炎症过程中其分泌增加，可促进白细胞、巨噬细胞等向炎症部位趋化，进而参与炎症过程。日舒安洗液联合克霉唑治疗小鼠后，小鼠的IL-2和IL-8显著降低，低于单用克霉唑治疗组。

NLRP3是一类炎性小体，炎性小体可诱导炎症的发生，其活化对炎症发展具有重要意义，为阐明病毒、真菌、细菌等炎症过程提供依据。目前NLRP3的相关研究较多[7]，NLRP3是由接头分子ASC、识别分子NLRP3以及效应分子半胱天冬酶1(caspase-1)组成[8]。本次研究中发现日舒安洗液联合克霉唑治疗小鼠后NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA表达均降低，与单用克霉唑治疗组相比具有统计学差异。

综上所述，日舒安洗液联合克霉唑能明显降低外阴阴道念珠菌病小鼠的真菌载量及炎症反应，治疗作用显著，优于单用克霉唑治疗。