miR-29a抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤

李海燕 郭琳 张倩 唐莉 马波

年龄相关性白内障是导致老年人失明的主要原因。随着人口老龄化的加剧，年龄相关性白内障患者的数量逐年增加[1]。晶状体上皮细胞的结构和功能对于维持晶状体的透明度至关重要[2]。氧化应激是年龄相关性白内障发病机制中的重要调节因子，可引起晶状体上皮细胞凋亡。过多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)能够破坏正常晶状体上皮细胞的功能，导致白内障的形成[3]。因此，抑制晶状体上皮细胞的氧化损伤是预防白内障发生的关键。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一类在人体内广泛分布、长度为19～25个核苷酸的内源性非编码RNAs。miRNAs主要通过与靶基因mRNA 3’端非编码区结合，引起翻译过程被抑制或者导致mRNA降解[4]。近年来的研究发现，mRNAs在白内障的发病过程中具有重要作用。miRNA let-7b和miR-211在年龄相关性白内障患者的晶状体前囊膜中异常表达，可调节晶状体上皮细胞凋亡[5-6]。Kubo等[7]的研究显示，miR-29a在白内障大鼠的晶状体中表达下调，但是目前miR-29a在白内障中的具体作用和机制还未见相关研究。H2O2是细胞内主要的ROS，因此我们使用H2O2刺激人晶状体上皮细胞，体外建立人晶状体上皮细胞氧化损伤模型，探究miR-29a对人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响，并探讨其在白内障发病过程中可能的作用和机制。

1 材料与方法

1.1材料人晶状体上皮细胞株HLE-B3(美国ATCC公司)，DMEM低糖培养基、胎牛血清和2.5 g·L-1胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco公司)，H2O2(美国Sigma 公司)，Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI流式细胞检测试剂盒(美国BD公司)，CCK-8试剂盒、RIPA裂解液、ROS检测试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(上海碧云天有限公司)，SuperQuick RT MasterMix和Super TaqMan Mixture(北京康为试剂生物科技有限公司)，TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan miRNA assay Kit试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，BCA法蛋白定量试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，Bcl2修饰因子(Bcl2 modifying factor，BMF)抗体和Bcl2拮抗/杀伤因子1(Bcl2-antagonist/killer 1，BAK1)抗体(上海吉玛基因公司)。miR-29a模拟物和对照模拟物序列由上海吉玛基因公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组将HLE-B3细胞接种到含有体积分数15%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中进行常规培养。待细胞贴壁生长至90%融合时使用胰蛋白酶消化，传代培养，取对数生长期细胞用于实验。使用不同浓度(0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1)的H2O2处理细胞，以确定后续实验中的H2O2浓度。将细胞分成四组：对照组、H2O2组、H2O2+模拟物对照组和H2O2+miR-29a模拟物组。其中对照组不进行任何处理，后三组均使用适宜浓度的H2O2处理，H2O2+模拟物对照组和H2O2+miR-29a模拟物组中分别转染对照模拟物和miR-29a模拟物。

1.2.2细胞转染和H2O2处理将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后，接种到特定的细胞培养板中，待细胞生长至70%融合时，按照试剂盒说明书操作转染对照模拟物和miR-29a模拟物48 h后，加入一定浓度的H2O2培养24 h，进行后续检测。

1.2.3CCK-8法检测细胞活力将未处理的或者转染24 h的细胞经胰蛋白酶消化后，按照每孔2000个细胞接种到96孔板中，培养24 h，加入适宜浓度H2O2刺激24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育1.5 h，然后在450 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。计算各组的细胞活力，即细胞活力=A处理组/A样品对照组×100%。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡将细胞接种到6孔板内，经过相应分组处理后，弃细胞培养液，胰蛋白酶消化后收集细胞，PBS洗涤2次，1000 r·min-1离心10 min，弃上清，用试剂盒中Binding Buffer悬浮细胞，调整细胞浓度为109个·L-1，然后按照试剂盒说明书操作加入Annexin V-FITC和PI，混匀后避光孵育20 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.5ROS水平和SOD含量检测ROS水平和SOD含量检测均严格按照试剂盒说明书操作。检测细胞内ROS水平时，先按照11000的比例用无血清DMEM培养基稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol·L-1。按照109个·L-1的细胞密度加入稀释好的DCFH-DA，细胞培养箱中孵育20 min。用无血清的DMEM培养基洗涤细胞3次(去除未进入细胞内的DCFH-DA)，然后使用荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长和发射波长分别为488 nm和525 nm。

检测细胞内SOD含量时，先用移液枪吸净细胞培养液，预冷的PBS洗涤细胞1次，然后加入100 μL SOD样品制备液裂解细胞，4 ℃、10 000 r·min-1离心5 min，取上清液按照试剂盒说明书加入各试剂。最后在450 nm波长处测定A值。

1.2.6总RNA提取和Real-timePCR用Trizol试剂盒提取各组细胞的总RNA，检测miR-29a的表达时使用TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit试剂盒将5 ng总RNA逆转录，按照TaqMan miRNA assay Kit试剂盒说明书进行操作，检测细胞中miR-29a的表达。检测BMF和BAK1 mRNA的表达时，用SuperQuick RT MasterMix逆转录试剂盒将 1 μg 总RNA逆转录后，使用Super TaqMan Mixture进行Real-time PCR检测。使用公式2-△△Ct计算目的基因的相对表达量，miR-29a以U6为内参，BMF和BAK1以GAPDH为内参。引物序列见表1。

全省机构改革动员大会后，厅党组连续召开专题会议、党组会议、党组扩大会议、市局局长座谈会，深入学习习近平总书记关于深化党和国家机构改革的重要论述、关于生态文明建设和自然资源管理的重要论述，传达贯彻全省机构改革动员大会精神和省级机构改革人员转隶及部门“三定”工作培训班要求，全面动员部署，扎实有序推进，比较圆满地完成了机构改革阶段性任务。

表1引物序列

基因上游引物下游引物miR-29a5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAA-3’5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’U65’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’BMF5’-TTCCCTCCTTCCCAATCGAG-3’5’-CCATCTCTCCTGGGTGACTC-3’BAK15’-GATCCCGGCAGGCTGATCC-3’5’-GTAGCTGCGGAAAACCTCCT-3’GAPDH5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’5’-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3’

1.2.7Westernblotting检测蛋白表达利用RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白，4 ℃高速离心15 min，收集上清液即为总蛋白。BCA试剂盒测定所提取的总蛋白浓度，每孔取40 μg总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，分离后将蛋白转移至PVDF膜上，用50 g·L-1脱脂奶粉封闭2 h，然后加入提前稀释的一抗4 ℃过夜孵育，TBS洗膜3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，将ECL发光液均匀加至膜上，拍照后用ImageJ软件分析条带的灰度值，检测各组BMF和BAK1蛋白表达情况。

2 结果

2.1H2O2浓度的确定CCK-8法检测不同浓度的H2O2对HLE-B3细胞活力的影响，结果显示，0 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1H2O2处理组中细胞活力分别为(99.17±3.76)%、(79.33±6.02)%、(59.67±8.83)%、(31.33±6.41)%和(14.00±6.36)%。HLE-B3细胞活力随着H2O2浓度的增加而逐渐降低，呈现剂量依赖性。后续实验中H2O2浓度选择200 μmol·L-1。

2.2各组miR-29a的表达200 μmol·L-1H2O2处理HLE-B3细胞，Real-time PCR检测细胞中miR-29a的表达，结果显示，与对照组相比，H2O2组中miR-29a的表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-29a模拟物组中miR-29a的表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，但H2O2+模拟物对照组中miR-29a的表达变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3各组细胞活力检测CCK-8法检测各组中HLE-B3细胞活力，结果见表2。与对照组相比，H2O2组中细胞活力降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-29a模拟物组中细胞活力增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，但H2O2+模拟物对照组中细胞活力变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2各组miR-29a表达及细胞活力

组别miR-29a表达细胞活力/%对照组1.03±0.0999.17±3.76H2O2组0.56±0.12∗59.67±10.09∗H2O2+模拟物对照组0.62±0.1254.50±12.86H2O2+miR-29a模拟物组4.49±0.55#92.83±8.09#F值251.4035.70P值0.000.00

注：与对照组相比，*P<0.05；与H2O2组相比，#P<0.05

2.4各组细胞凋亡情况流式细胞术检测各组细胞凋亡，结果见图1。对照组、H2O2组、H2O2+模拟物对照组和H2O2+miR-29a模拟物组中细胞凋亡率分别为(3.53±1.21)%、(40.30±4.76)%、(42.32±6.35)%和(18.74±2.48)%。与对照组相比，H2O2组中细胞凋亡率显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-29a模拟物组中细胞凋亡率显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，但H2O2+模拟物对照组中细胞凋亡率变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5各组ROS水平和SOD含量检测各组中ROS水平和SOD含量，结果见表3。与对照组相比，H2O2组中ROS水平升高，SOD含量减少，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-29a模拟物组中ROS水平降低，SOD含量增加，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，但H2O2+模拟物对照组中两者变化均不大，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.6各组BMF和BAK1的表达Real-time PCR和Western blotting检测各组中BMF和BAK1 mRNA和蛋白的表达，结果见图2和表4。与对照组相比，H2O2组中BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达水平均增加，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；与H2O2组相比，H2O2+miR-29a模拟物组中BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达水平均降低，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，但H2O2+模拟物对照组中两者mRNA和蛋白表达变化均不大，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

表3各组ROS水平和SOD含量

组别ROS /%SOD/U·mL-1对照组101.31±7.3790.26±3.98H2O2组299.52±43.95∗52.97±6.64∗H2O2+模拟物对照组285.25±57.6653.89±10.78H2O2+miR-29a模拟物组143.13±21.32#84.03±6.31#F值41.5042.85P值0.000.00

注：与对照组相比，*P<0.05；与H2O2组相比，#P<0.05

图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

3 讨论

图2 Western blotting检测BMF和BAK1蛋白表达。1：对照组；2：H2O2组；3：H2O2+模拟物对照组；4：H2O2+miR-29a模拟物组

miR-29a是近年来广泛研究的一个mRNA。它在多种生命过程中发挥重要作用，如成骨分化[8]、血糖调节[9]和多种癌症[10]等。研究发现，miR-29a在白内障大鼠的晶状体中表达下调[7]，但是目前还未见miR-29a在白内障中具体作用和机制的相关研究。本研究中我们发现，H2O2刺激后HLE-B3细胞中miR-29a的表达下调，这与miR-29a在白内障大鼠晶状体中的表达结果[7]相一致。

晶状体上皮细胞凋亡在白内障形成过程中具有重要作用，并且H2O2诱导的氧化应激能够引起晶状体上皮细胞凋亡[3，11]。本研究我们通过转染miR-29a模拟物在HLE-B3细胞中过表达miR-29a，探究miR-29a对晶状体上皮细胞凋亡的影响，结果发现，与H2O2组相比，上调miR-29a表达增加了HLE-B3细胞的活力，减少了细胞凋亡。现普遍认为，氧化应激是促氧化剂与抗氧化剂之间的一种不平衡状态。有研究显示，氧化应激诱导的晶状体上皮细胞线粒体损伤会增加ROS水平[12]。SOD是抗氧化防御系统中能够清除自由基的一种重要酶。本研究发现，上调miR-29a表达能够降低H2O2诱导的细胞内ROS水平，增加SOD的含量。这些结果表明， miR-29a能够减少H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤。

表4各组BMF和BAK1mRNA和蛋白表达

组别BMFmRNA蛋白BAK1mRNA蛋白对照组1.03±0.100.13±0.051.02±0.080.10±0.06H2O2组2.54±0.18∗1.17±0.09∗3.49±0.23∗0.99±0.15∗H2O2+模拟物对照组2.46±0.381.23±0.153.33±0.421.05±0.12H2O2+miR-29a模拟物组1.46±0.20#0.50±0.09#1.60±0.19#0.37±0.08#F值61.0085.28133.0157.17P值0.000.000.000.00

注：与对照组相比，*P<0.05；与H2O2组相比，#P<0.05

BMF是Bcl-2凋亡相关蛋白BH3-only家族中的一个促凋亡成员。有研究发现，上皮细胞失去对其基膜的黏附后，BMF诱导这些细胞发生凋亡[13]。BAK1是Bcl-2家族的一员，它是线粒体凋亡的一个重要调节分子[14]。已有研究显示，在人正常肝细胞系L02中，H2O2处理能够上调BMF的表达[15]。在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中，H2O2处理能够增加BAK1的表达[16]。本研究中我们发现，H2O2处理HLE-B3细胞后，BMF和BAK1的表达均上调。Xia等[17]的研究发现，BMF和BAK1是miR-29a的靶基因。因此，本研究我们进一步探究了在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞中miR-29a与BMF和BAK1的关系。结果发现，在人晶状体上皮细胞中，过表达miR-29a能够下调H2O2诱导的BMF和BAK1表达。

综上，本研究结果表明，miR-29a能够抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤，这可能是通过下调BMF和BAK1的表达发挥作用的。随着研究的深入，miR-29a有望为白内障的非手术治疗提供新靶点。