CD151对结肠癌细胞WNT信号通路的影响机制分析△

刘学刚，刘艳彩，吴春平，李景光，赵岭岭，张振亚#

衡水市第四人民医院1普外科，2病理科，河北 衡水 0530000

结肠癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率一直居高不下。多项研究均证明，在结肠癌的发生与发展中，WNT信号转导通路发挥了重要的作用[1-2]。WNT信号转导通路是由一系列癌基因和抑癌基因编码的蛋白质组成，在调节胚胎发育、细胞转运及细胞调亡等过程中发挥了显著作用[3]。肿瘤转移是导致结肠癌患者病死率较高的主要原因之一[4]，研究表明，CD151在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用[5]。CD151属于4次跨膜结构超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成员之一，是TM4SF中唯一的癌基因，能够促进细胞的运动，肿瘤的侵袭和转移，并且能够通过稳定新生血管的结构，为肿瘤的侵袭及转移提供必要条件[6]。然而目前CD151与WNT信号通路的关系少见报道。本实验通过比较裸鼠移植瘤中的人结肠癌细胞HT29、敲除CD151基因的HT29细胞（CD151－-HT29）的β-catenin基因及蛋白的表达变化，探究CD151对结肠癌细胞WNT信号通路的影响机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及细胞

RPMI1640培养基购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，荧光二抗购自广州华拓生物科技有限公司，β-catenin抗体以及β-actin抗体均购自美国Abcam公司。HT29细胞以及CD151－-HT29细胞均购自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 实验动物

20只BALB/c-nu/nu雄性裸鼠[购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，SCXK（沪）2012-0002）]，体重（22±2）g，在无菌环境中饲养，裸鼠所用饲料、饮用水、垫料均经过高压灭菌处理。

1.3 实验方法及观察指标

1.3.1 细胞培养 从-80℃冰箱中取出HT29和CD151－-HT29细胞冻存管，放在37℃恒温水浴锅中快速解冻，将解冻好的细胞快速放入事先准备好的装有10 ml RPMI1640培养基的15 ml离心管中，离心去上清，重新加入5 ml新培养基，用吹打管小心吹打混匀细胞，转移至100 cm3的细胞培养瓶中，补足培养液，放入细胞培养箱中培养。待细胞培养瓶中的细胞长满至80%时，即可传代培养，用于后续实验。

1.3.2 荷瘤鼠模型的建立 将状态良好的裸鼠随机分为两组，每组10只，分别设为对照组及观察组，对照组裸鼠注入HT29细胞，观察组裸鼠注入CD151－-HT29细胞。建模前需要将处于对数生长期的HT29、CD151－-HT29细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）使细胞重新分散，细胞终浓度为1×107/ml。将准备好的细胞悬液注射入裸鼠腋下，一切操作在无菌环境下进行。1周后可明显观察到肿瘤形成，3周后处死裸鼠，取出肿瘤组织，放入-20℃冰箱中保存，备用。

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹（Western blot）技术检测蛋白表达水平采用Western blot技术检测HT29、CD151－-HT29细胞形成的肿瘤组织中CD151、β-catenin和β-actin蛋白表达情况。具体操作步骤如下：先制备分离胶、浓缩胶，待浓缩胶凝固后，竖直向上拔起齿梳；将计算好体积的蛋白样品通过移液枪转入至加样孔中，开始电泳，待电泳结束后，开始转膜，再与抗体发生免疫反应，最后放入至电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒中显色及显影。将胶片放入凝胶成像系统中拍照，用Quantity One图像分析软件分析目标条带的分子量和光密度值。

1.3.4 免疫组化技术检测蛋白表达情况 采用免疫组化技术检测肿瘤组织中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表达情况。将离体不超过30 min的肿瘤组织置入4%的多聚甲醛中固定24 h，取固定后的肿瘤组织依次经30%、50%、70%、80%及90%的梯度乙醇脱水，每次30 min。再用二甲苯脱乙醇，20 min后放入石蜡中包埋。将制备好的肿瘤组织石蜡切片分别采用100%、95%及80%的乙醇进行脱蜡，放入3%H2O2溶液中孵育5～10 min，以灭活内源性过氧化物酶。使用蒸馏水冲洗，抗原修复，PBS冲洗3次，滴加一抗，室温孵育2 h，PBS冲洗3次，二抗孵育20 min后，再用PBS冲洗3次。DAB染色，染到适宜程度时，使用蒸馏水冲洗终止染色，苏木精染色1 min，1%盐酸乙醇浸泡30 s，1%氨水乙醇浸泡45 s，再分别用85%、90%及100%梯度乙醇各处理切片1 min，二甲苯透化2次。根据阳性细胞（以出现灰黄色、金黄色或棕黄色颗粒记为阳性细胞）所占比例及染色强度对切片共同评分，即采用双评分半定量法。根据阳性细胞所占比例，将切片划分为4个等级：＜25%为1分，25%～49%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分；根据切片的染色强度，将切片划分为4个等级：基本无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。将两种评分相加得最终总分，总分≤3分为阴性，总分＞3分则为阳性。分别对肿瘤组织中的Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表达情况进行初步评估。

1.3.5 实时定量聚合酶链式反应技术检测基因表达情况 采用实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术检测HT29、CD151－-HT29细胞形成的肿瘤组织中β-catenin基因的表达情况。将取出的肿瘤组织匀浆，向其中加入1 ml的TRIzol试剂提取细胞总RNA，反复吹打使细胞从培养瓶壁上完全脱落。将培养瓶中剩余液体全部转移至EP管中，匀浆，离心取上清转移至新EP管中，向其中加入0.5 ml异丙醇，混匀后在室温下放置10 min，离心后可在EP管的底部和侧壁上观察到胶状沉淀，即为RNA，弃去上清，加入1 ml 75%乙醇对RNA沉淀进行漂洗后离心收集纯净的RNA，室温下干燥，放于-80℃下保存备用。每20 μl反转录体系中加入1 μl的RNA，振荡摇匀，短暂离心富集RNA，将EP管放入至自动PCR仪中检测基因表达情况。以βactin作为内参，β-actin上游引物序列为5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物序列为5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；β-catenin上游引物序列为5'-TTGAAAATCCAGCGTGGACA-3'，下游引物序列为5'-TCGAGTCATTGCATACTGTC-3'。

最终采用2-△△Ct法计算目的基因的表达量。计算公式：△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct观察组-△Ct对照组。2-△△Ct表示观察组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，当2-△△Ct＞1时，表明观察组目的基因水平高于对照组，基因表达上调；当2-△△Ct=1时，表明观察组目的基因水平等于对照组，基因表达未发生改变；当2-△△Ct＜1时，表明观察组目的基因水平低于对照组，基因表达下调。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统-计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD151、β-catenin和β-actin蛋白表达情况的比较

采用Western blot技术分别检测对照组和观察组裸鼠肿瘤组织中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表达情况，结果显示对照组裸鼠肿瘤组织中存在明显的CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表达，而观察组裸鼠肿瘤组织中并不存在CD151蛋白的表达（图1），证明CD151-荷瘤鼠模型建立成功。在此基础上，对两组裸鼠肿瘤组织中的β-catenin相对表达量（与β-actin的比值）进行比较，结果显示，对照组β-catenin相对表达量为（0.18±0.02），与观察组的（0.13±0.01）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 Western blot技术检测两组裸鼠肿瘤组织中CD151、β-catenin和β-actin蛋白的表达情况

2.2 Wnt1a、Oct4蛋白表达情况的比较

采用免疫组化法分别检测对照组和观察组裸鼠肿瘤组织中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白的表达情况，结果显示观察组裸鼠的肿瘤组织中Wnt1a蛋白、Oct4蛋白表达量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2、表1）

图2 免疫组化法检测两组裸鼠肿瘤组织中Wnt1a、Oct4蛋白表达情况（SP染色，×200）

表1 两-组肿瘤组织中Wnt1a、Oct4蛋白表达情况的比较（x±s）

2.3 β-catenin mRNA相对表达量的比较

采用qRT-PCR技术检测对照组与观察组裸鼠肿瘤组织中β-cateninmRNA的表达情况，对照组β-cateninmRNA的表达量为（1.01±0.05），明显高于观察组的（0.43±0.04），差异有统计学意义（t=22.188，P＜0.01）。

3 讨论

随着人类社会的发展和生活水平的不断提高，结肠癌的发病率也在逐年升高，目前临床上治疗结肠癌的主要手段为手术切除肿瘤部位，但是在患者手术前，肿瘤很可能已经发生转移，因此肿瘤无法得到根除并且复发率高[7-8]。目前，探究肿瘤的发生、发展以及转移机制已经成为治疗结肠癌的热点问题，如何抑制肿瘤的转移很可能会成为结肠癌治疗的下一个突破口。

众所周知，肿瘤的转移机制十分复杂，目前有研究表明，肿瘤的转移与肿瘤内部微血管的形成有关且与WNT信号通路密切相关[9-10]。WNT信号通路是由一系列癌基因以及抑癌基因编码表达的蛋白质组成，能够抑制β-catenin的降解，导致细胞质内的β-catenin增多，引起T细胞因子转录水平提高，促进多种靶基因激活，如原癌基因c-Jun、可异位基因c-myc和基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）等，这些靶基因在肿瘤的生成、发展以及转移中发挥了重要作用[11-13]。而CD151蛋白能够促进肿瘤血管的生成，并且能够形成CD151-整合素复合体系统维持新生血管的稳定[14-15]。本实验结果发现，与对照组相比，观察组裸鼠肿瘤组织中β-catenin蛋白及mRNA表达均有下降，初步推测CD151可能是WNT信号通路的上游基因，对WNT信号通路相关蛋白表达有调控作用。本研究结果还表明，对照组裸鼠肿瘤组织中存在明显的CD151蛋白表达，而观察组肿瘤组织中并不存在CD151蛋白的表达，这一结果说明CD151基因缺失的结肠癌荷瘤鼠模型建立成功。采用Western blot技术检测β-catenin和β-actin蛋白的表达水平，发现观察组裸鼠肿瘤组织中的β-catenin相对表达量低于对照组，但差异无统计学意义，这可能与样本量较少有关。当WNT信号通路尚未被激活时，β-catenin蛋白能够维持细胞上皮的完整性，降低肿瘤转移成功率，一旦WNT信号通路被激活，β-catenin蛋白在细胞核中大量表达并发生集聚，从而失去维持细胞上皮完整性的功能，并且β-catenin蛋白能够促进血管内皮生长因子的表达[16-17]。本研究结果同样发现，对照组裸鼠肿瘤组织中Oct4蛋白表达量高于观察组。Oct4蛋白在维持干细胞的正常功能以及自我更新中发挥了重要的作用，也是WNT信号通路中的重要成员[18-19]。

肿瘤的发生、发展及转移之间的机制构成了一个复杂的网络体系。目前，WNT信号通路的作用机制及相互作用也并未全部诠释出来，本文从研究CD151与WNT信号通路之间关联的角度出发，以期能够揭示结肠癌的发生、发展过程，为临床上结肠癌的治疗寻找新的突破口。