扶正固本颗粒联合顺铂对S180荷瘤小鼠T细胞免疫功能调节作用的研究

2019-03-14谭灏杨伟晗康永刘聪李祥

癌症进展 2019年3期

谭灏，杨伟晗，康永，刘聪，李祥

山西省中医药研究院，太原 0300120

恶性肿瘤已经成为中国重要的公共卫生问题，自2010年来，恶性肿瘤已经超过心脑血管疾病，成为中国人群第一大死因。预计在未来几十年内，中国恶性肿瘤的发病和病死人数将呈持续上升趋势[1]。临床上化疗通常作为肿瘤治疗的辅助手段，配合手术治疗、放疗应用。顺铂是典型的铂类药物之一，在临床实践中发现顺铂化疗后患者会出现免疫功能减退、骨髓抑制、食欲下降等一系列不良反应，这与中医的正气虚、脾气虚所表现出的症状相似，此时应用中西医结合疗法往往可以获得良好的疗效[2-3]。扶正固本颗粒有良好的临床疗效基础，由黄芩、淫羊藿、女贞子、何首乌等8味中药组成，具有益气养阴、凉血解毒等功效，常用于放化疗后气阴两虚兼热毒症合并用药。本研究探讨扶正固本颗粒联合顺铂对荷瘤小鼠T细胞免疫功能的影响，旨在为扶正固本颗粒作为肿瘤化疗辅助用药的临床应用提供实验依据，以期加大其用药范围，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 瘤株 S180腹腔积液瘤瘤株购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2 动物昆明种小鼠120只，体重（10±2）g，雌雄各半，购自中国辐射防护研究院。

1.1.3 仪器垂直净化工作台购自苏州净化设备有限公司，SC-3610低速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，细胞培养箱购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，AXIO HAL100电子显微镜购自上海成贯仪器有限公司，血球计数板购自江苏康健华医疗用品有限公司，流式细胞仪Cytomics FC 500（COULTER TQ-Prep工作站）购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 建立荷瘤小鼠模型 S180小鼠瘤株经腹腔接种方式传代，连续传代至第3代后，颈椎脱臼法处死后移入预先进行消毒的净化工作台上，腹部皮肤消毒后切开，暴露腹腔，抽取腹腔积液放入无菌试管中，用血球计数板进行细胞计数，调整细胞密度至1×107/ml，每只小鼠右腋部皮下接种0.2 ml。每日观察肿瘤生长情况，肉眼观察及手触判断建模是否成功[4]。

1.2.2 动物分组及给药接种次日将荷瘤小鼠随机分为6组：空白组，无任何处理；模型组：等体积蒸馏水灌胃；化疗组：顺铂注射液（1 mg/kg）腹腔注射；低、中、高剂量组：顺铂注射液（1 mg/kg）腹腔注射联合扶正固本颗粒（5.625、11.250、22.500 g/kg）灌胃给药。每日给药1次，共10天，全部建模完成，未见小鼠死亡。

1.2.3 小鼠生长情况的观察肉眼观察各组小鼠的毛色、活动状态，记录体重变化及死亡情况。

1.3 观察指标及评价标准

给药前及给药结束称量小鼠体重，对比体重的增长程度。小鼠末次给药后24 h脱颈椎处死，迅速剥取肿瘤、胸腺和脾脏并称重，按下列公式计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数。抑瘤率=（模型组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量）/模型组平均肿瘤质量×100%，胸腺（脾脏）指数=胸腺（脾脏）质量（mg）/小鼠体重（g）×10。

末次给药24 h后摘除眼球取血，收集血液，用流式细胞仪检测荷瘤小鼠外周血中CD4+、CD8+、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）水平及 Th1/Th2、Th17/Treg 的比值变化。因实验材料原因，此部分研究每组各抽取16只小鼠进行实验。

1.4 统计学分析

采用SPSS 24.0统计-软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠生长情况

除空白组外，各组荷瘤小鼠均出现不同程度的活动受限。模型组小鼠皮毛疏密及光泽程度与空白组比较无明显变化；化疗组小鼠瘤体缩小明显，活动受限程度较模型组轻，但毛色暗淡，无光泽且皮毛稀疏；低、中、高剂量组小鼠毛色光亮，皮毛紧实，活动受限程度较模型组轻，较化疗组重。实验过程中未见小鼠死亡。

2.2 体重、瘤重、抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数的比较

与模型组比较，化疗组与低、中、高剂量组均能抑制小鼠的体重增长，差异均有统计学意义（P＜0.05）；低、中、高剂量组小鼠体重增长均多于化疗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。化疗组与低、中、高剂量组小鼠瘤重均小于模型组小鼠，差异均有统计学意义（P＜0.05）；低、中剂量组小鼠瘤重均大于化疗组小鼠，差异均有统计学意义（P＜0.05）。根据抑瘤率公式可计算出抑瘤率分别为化疗组65.5%，低剂量组43.2%，中剂量组44.0%，高剂量组57.6%。化疗组与低、中剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量组胸腺指数均高于化疗组，低、中、高剂量组脾脏指数均高于化疗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 各组荷瘤小鼠体重增长、瘤重、胸腺指数、脾脏指数的比较（±s）

注：a与模型组比较，P＜0.05；b与化疗组比较，P＜0.05

组别空白组（n=20）模型组（n=20）化疗组（n=20）低剂量组（n=20）中剂量组（n=20）高剂量组（n=20）F值P值体重增长（g）6.26±2.02 5.70±2.35-0.47±3.96a 1.99±1.40a b 3.14±2.52a b 4.77±2.39a b 27.134 26.029瘤重（g）—3.10±0.72 1.15±0.71a 2.21±0.93a b 2.14±0.58a b 1.34±0.40a 0.000 0.000胸腺指数31.90±7.23 28.48±3.49 15.05±2.55a 15.55±3.19a 16.48±4.93a b 21.08±3.29a b 9.489 1.533脾脏指数61.65±19.60 57.66±13.43 43.08±14.84a 46.99±17.35a b 48.36±16.73a b 58.03±13.33b 0.000 0.000

2.3 CD4+、CD8+水平的比较

与模型组比较，化疗组小鼠血液中CD4+水平降低，CD8+水平提高，低剂量组小鼠CD8+水平提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与化疗组比较，中、高剂量组CD4+水平均提高，CD8+水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 各组荷瘤小鼠CD4+、CD8+水平的比较（%，±s）

注：a与模型组比较，P＜0.05；b与化疗组比较，P＜0.05

组别空白组（n=16）模型组（n=16）化疗组（n=16）低剂量组（n=16）中剂量组（n=16）高剂量组（n=16）F值P值CD4+31.13±9.12 30.86±9.26 25.70±3.68a 26.00±5.42 28.79±5.35b 29.44±7.34b 4.423 7.039 CD8+25.57±4.25 27.85±5.61 36.66±6.54a 35.23±6.14a 31.08±6.44b 29.99±4.77b 0.001 0.000

2.4 外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比较

与模型组比较，化疗组小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，Treg水平提高，低、中剂量组小鼠外周血中Th1、Th17水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与化疗组比较，中、高剂量组小鼠外周血中Th1、Th17水平均提高，高剂量组Th2、Treg水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表 3）

表3 各组荷瘤-小鼠外周血中Th1、Th2、Th17、Treg水平的比较（%，x±s）

2.5 外周血中Th1/Th2、Th17/Treg的比较

与模型组比较，化疗组与低、中、高剂量组小鼠外周血中Th1/Th2均降低，化疗组与低、中剂量组Th17/Treg均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与化疗组比较，低、中、高剂量组小鼠外周血中Th1/Th2均提高，高剂量组Th17/Treg水平提高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

3 讨论

肿瘤患者在进行化疗时需要营养支持，若没有足够的营养支持，一定程度上会成为死亡原因[5]。除了危重患者需要静脉营养支持，在中国传统医学的观念中，经过口-消化道摄取营养是对人体最好的，所以扶正固本颗粒能在一定程度上改善因营养摄取不足而导致病情恶化的情况。作为动物免疫系统的第一道防线，脾脏和胸腺的重量及免疫器官指数是反映实验动物的非特异性免疫与特异性免疫的最基本指标[6]，免疫功能减退小鼠的脾脏指数和胸腺指数明显低于正常小鼠。本实验结果提示扶正固本颗粒联合顺铂能提高荷瘤小鼠胸腺及脾脏指数，增强机体的免疫功能。CD4+是一类辅助性T细胞，活化后可释放大量细胞因子，对细胞免疫起正调节作用，CD8+T细胞又被称为抑制性T细胞，对细胞免疫起负调节作用[7-8]。本实验结果提示中、高剂量扶正固本颗粒联合顺铂能提高荷瘤小鼠CD4+水平，降低CD8+水平，反映中、高剂量扶正固本颗粒有利于动物体内T细胞亚群增殖，以提高整体T细胞免疫功能。CD4+T细胞是重要的Th细胞，在免疫反应的不同阶段都会有CD4+T细胞的参与，根据其分泌细胞因子不同，可以分为Th1和Th2细胞亚群，Th1主要参与细胞免疫，通过分泌白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），介导细胞毒性T细胞反应，提高免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-2、IL-6、IL-10等，主要参与体液免疫，起到免疫抑制作用。当机体处于Th2细胞因子优势下，往往成为肿瘤免疫逃逸的原因。Th17细胞主要通过分泌IL-17、TNF-α活化中性粒细胞，并有研究表明，Th17细胞通过募集Th1细胞发挥抗肿瘤效应[9]。Treg细胞是一群具有免疫抑制作用的细胞群，Treg细胞数量增多也会增大肿瘤免疫逃逸的机会[10]。荷瘤小鼠外周血中Th1/Th2、Th17/Treg平衡被打破，优势倾向Th2、Treg一方，说明小鼠免疫功能被抑制，而这种抑制会导致肿瘤免疫逃逸的发生。本实验中，高剂量扶正固本颗粒联合顺铂能提高Th1/Th2、Th17/Treg比值。