抗肿瘤抗生素棘霉素的研究进展
2019-03-13单传坤李良
单传坤，李良
(中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京 100050)
1 前言
非核糖体肽(nonribosomal peptides, NRP)是一类通过非核糖体途径合成的代谢产物。棘霉素(echinomycin)是醌霉素(quinomycin)家族中一员，属于NRP，是链霉菌产生的环肽类次生代谢产物。NRP的合成由多种多功能蛋白复合体完成，其中包括非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)复合体。研究表明，NRPS完成棘霉素大部分的生物合成，同时在生物合成基因簇编辑的具有多种功能的酶的催化下，最终形成具有双生色团的环肽类化合物。棘霉素的环肽骨架由多种不同的氨基酸构成，这种环肽骨架是由NRPS催化两条相同的多肽链首尾相连而成[1]。目前研究发现，棘霉素的药理活性不仅是DNA的嵌入剂，还是乏氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的小分子抑制剂，能够发挥抗肿瘤作用。近年来，棘霉素作为一种具有生物学活性的天然产物，其生物合成和抗肿瘤作用机制一直被广泛研究，本文将从棘霉素的生物合成、抗肿瘤作用机制和应用三方面进行综述。
1 棘霉素的生物合成
1.1 棘霉素的结构特征
从棘霉素分子结构(图1)可以看出，其不仅具有环肽骨架，骨架间半胱氨酸残基形成硫缩醛结构，还具有两个特征性喹喔啉生色团结构，该基团是棘霉素抗肿瘤作用的活性基团。
1.2 棘霉素的生物合成
棘霉素生物合成基因簇(Ecm)已经被研究者发现，研究人员提出其合成途径假说，并且部分合成途径假说被证实，但其具体的生物合成机制一直在研究中[2-5]。根据棘霉素结构特征，其生物合成包括生色团的生物合成和环肽骨架的生物合成。首先是生色团的生物合成。L-色氨酸被广泛证实为生色团生物合成的起始化合物[5-6]。Watanabe等[2,6-8]首次运用大肠埃希菌作为模式生物体，构建棘霉素生物合成基因并将其导入大肠埃希菌，组装具有生物活性的非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)复合体，验证了喹喔啉—甲酰基(QXC)生色团合成途径假说部分内容(图2)，由1(L-tryptophan，L-色氨酸)到2(quinoxaline-2-carboxylic acid, 喹喔啉-2-甲酸，QC)。他们预测基因簇中的八个(Ecm2～Ecm4，Ecm8，Ecm11～Ecm14)[4]基因编码完成从L-色氨酸到QC的转化。
其次是环肽骨架的生物合成。QC被加载到由Ecm1、Ecm6、Ecm7编码的多酶复合体并完成侧链的延伸，由Ecm7编码的NRPS上的Ecm TE催化两条多肽链同源二聚化，后面再经过环化，使得两条肽链间的游离巯基空间距离变的更近，经过Ecm7 NRPS氧化后，形成3(Triostin A，三骨菌素A)，最后一步，在Ecm18 NRPS中的S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的催化下二硫键变为硫缩醛结构4。并且证明了(2S，3S)β-羟基色氨酸是一个关键的中间体。
在生色团合成过程中，有多种特殊功能的蛋白也参与其中。例如ecm8编码的一种类MbtH蛋白(MbtH-like protein, MLP)[9]对NRPS复合体中腺苷酰化结构域(adenylation, A)的可溶性表达/活性至关重要[10]，而后者直接影响NRPS合成过程中氨基酸的加载。张晨等[3,11]研究细胞色素P450羟化酶对游离的L-色氨酸有无作用时发现，此羟化酶仅催化已加载到NRPS蛋白的色氨酸残基进行β-羟化。
通过对棘霉素生物合成机制的研究，不仅能够了解这类天然活性化合物的代谢过程，还能够通过对合成途径进行改造，构建模式生物和天然产物化合物库[7,12]。
2 棘霉素的作用机制
棘霉素平面结构中包含两个能嵌入DNA的生色团，因此被称为DNA的双嵌入剂。棘霉素与DNA的这种结合是其生物活性的基础。早期研究中，认为棘霉素与DNA的结合没有特异性，后来大量X射线衍射[13]、DNA印记和核磁共振波谱实验证实其对富含GC位点的DNA有结合偏好，这与其他嵌入剂如三骨菌素A和luzopeptin A不同，他们对富含AT位点的DNA有结合偏好。
在当棘霉素与DNA结合后，会抑制拓扑异构酶II[14]，DNA解旋酶[15]和DNA甲基转移酶[16]的活性，从而抑制DNA的复制和RNA的生物合成。当棘霉素结合的DNA位点为启动子结合位点时，不同结合部位还能引起不同的生物现象，例如棘霉素能够特异性抑制HIF-1与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)启动子中内源性乏氧应答元件的结合[17]，从而抑制乏氧对VEGF mRNA诱导表达的作用。
3 棘霉素在分子生物学研究中的应用
基于棘霉素与生物大分子(核酸和蛋白质)的直接结合作用的应用。
图1 棘霉素分子结构
图2 棘霉素生物合成简图
Wu等[18]的研究发现，棘霉素对T:T错配隔断的富含GC的位点有偏好结合，并且其错配修复缺陷肿瘤细胞抑制作用更强，棘霉素的这一特点未来或许可以用于错配修复缺陷肿瘤的诊断和治疗。DNA杂交生物芯片能实现不同环境下感染因子的精确检测，Hakan等[19]在研发这种芯片时发现棘霉素与DNA作用能产生氧化信号，并且这种信号强于腺嘌呤和鸟嘌呤产生的信号，棘霉素的引入极大的提高了DNA杂交检测的灵敏度。Joan等[20]根据棘霉素与ACGT位点选择性结合[21]这一特点，运用涨落定理(fluctuation theorems)研究结合反应中能量变化、选择性和变构效应。
棘霉素不仅能与核酸结合，还能与与蛋白质结合形成复合体。Singh等[22]运用表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)技术，证实棘霉素能够与FKBP12(FK506 binding protein 12, FKBP12)结合，影响mTOR信号通路活性。这也许也是棘霉素抗肿瘤作用的一条信号通路。
4 棘霉素在抗肿瘤等方面的应用
4.1 棘霉素的抗肿瘤作用
Cha等[23]在研究HIF-1α对甲状腺乳头状癌肿瘤发生发展的影响时，发现他们选择的四种HIF-1α抑制剂中，棘霉素抑制甲状腺癌细胞增殖和克隆形成作用最强，在裸鼠动物实验中，手术剥离瘤块＋棘霉素化疗组也显示出最高的存活率。Ahn等[24]在舌癌动物模型中发现，HIF-1手术前后靶向化疗能显著延小鼠的生存时间。Wan等[25]在研究乏氧对胶质母细胞瘤迁移有无影响时，运用棘霉素作为HIF-1的小分子抑制剂，抑制乏氧诱导的Drp1蛋白表达，证明了Drp1蛋白参与乏氧对胶质母细胞瘤U251诱导迁移过程。Thangasamy等[26]在研究乏氧诱导的乳腺癌细胞侵袭作用时发现，HIF-1能够与RON启动子结合，而棘霉素能够调低RON基因的表达，从而使RON介导的乳腺癌细胞侵袭作用减弱。
Wang等[27]在肿瘤干细胞的研究中发现，尽管肿瘤干细胞与正常干细胞有相似性，棘霉素却能够选择性抑制肿瘤干细胞的克隆形成，而不影响骨髓中造血母细胞的克隆形成。这种对肿瘤干细胞的选择性，也许能够降低其副作用。随后，他们在研究急性骨髓性白血病时发现，棘霉素能够靶向白血病起始细胞，而对造血干细胞没有影响[28]。Ponnurangam等[29]在胰腺癌干细胞(Cancer stem cells,CSCs)的研究中发现，棘霉素能显著抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长，并且显著降低CSCs蛋白标志物的水平。
4.2 棘霉素的其它应用
Janjić等[30-31]在研究乏氧和含羞草素对牙髓源性细胞血管生成素分泌的影响中，棘霉素能减弱细胞对含羞草素和乏氧的响应能力，降低细胞内血管生成素mRNA的水平。他们还运用棘霉素研究牙髓源性细胞的核心生物钟基因对乏氧和含羞草素的反应性[32]，并发现细胞蛋白水平和mRNA水平对棘霉素的反应性存在差异。
棘霉素还表现出显著的抗疟疾和抗原虫活性[33-34]，它的抗疟疾作用的IC50值比氯喹低100倍[35]。
5 棘霉素研究新趋向
近年来的研究发现，棘霉素不仅能作用于DNA，更能作用于特定靶点，这其中以其对HIF-1的作用最为突出，大部分研究中，棘霉素都作为靶向HIF-1的抑制剂。有这种新的应用前景，棘霉素也许能够开发成靶向HIF-1的药物。同时，通过对其生物合成过程的研究，构建生物类似物库，也许能从中发现毒性更小的化合物。通过对其抗肿瘤作用机制和应用的研究，将来或许能找到更多的作用靶点。通过改变其给药剂型，也许能够降低其体内毒性，在临床研究中走的更远。
