抗菌药物敏感性体外检测系统质量控制标准

郭世富 编译

(1 国家食品药品监督管理总局医疗器械标准管理中心，北京 102629)2 中国食品药品检定研究院，北京102629)

1 前言

多年来，由于临床上广泛大量使用种类繁多的抗菌药物，细菌的耐药性越来越普遍，有的细菌可同时耐受多种药物，耐药菌株的广泛传播给临床治疗带来了很大的困难。同时，临床诊治手段不断更新，在提高诊断和治疗效果同时，也带来了更多的交叉感染机会，使机体的免疫状态趋于低下。感染类型的变化对临床微生物药敏的检测提出了更高的要求。

药物敏感试验是指抗菌药物在体外对病原体有无抑制或杀灭作用的实验。抗菌药物敏感性体外检测，目的是了解病原微生物对各种抗生素的敏感程度，以指导临床合理选用抗生素药物。实施抗菌药物敏感性试验可预测抗菌治疗的效果，包括“敏感”治疗可能有效，“耐药”肯定失败，提供所选择药物的依据，监测耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染病流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。

各种细菌对不同抗菌药物的敏感性不同，同一种细菌中不同菌株的药敏也常有差异。药敏实验结果对临床合理选用抗菌药物有重要的参考价值。

2 抗菌药物敏感性检测的方法

为测定微生物对某一抗感染药的敏感性，通常应用最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)表示，MIC值越高说明该微生物对该抗生素的敏感性越低。葡萄球菌药敏板使用微量稀释法进行MIC值的测定。

目前，被普遍应用的临床药敏试验方法和“抗药”或“敏感”的分界点判定标准是美国临床标准实验室(CLSI)上世纪七十年代年提出的。通常以琼脂或肉汤稀释法和纸片扩散法测定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，并根据药敏分界点(breakpoint)判定标准判断敏感与抗性。

纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，通过细菌生长情况来判断药物对微生物的MIC值。纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。此法在临床实验中存在一次性检测药物少、无法定量MIC值的缺点。

稀释法是在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列(对倍)稀释后，定量接种待检菌，一定温度一定孵育时间后观察。抑制待检菌肉眼可生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度(MIC)。

稀释法通常通过微生物药敏板进行，但存在药敏板条种类较少，不能满足各种类型细菌的药敏实验的情况，与此同时，药敏板条中抗生素的浓度梯度较少，大部分只可报告定性的敏感、中度敏感和耐药结果，而不能准确的报告出药物的MIC值。对药物抗菌的评价有三种：敏感(S)、中介(I)、耐药(R)。

“敏感”类是指分离菌株能被使用推荐剂量在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。

“中介”类包括这些菌株，其抗微生物药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗微生物药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着药物在生理浓集的部位具有临床效力[如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如β-内酰胺类)。此分类还包括一个缓冲区，它可以避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物]。

“耐药”类是指分离菌株不被常规剂量用药通常可达到的药物浓度所抑制，和/或证明抑菌环直径落在可存在某些特定的微生物耐药机制范围(如β-内酰胺酶)，并且治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠。

近年来Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)对于一些药敏试验判定标准变动频繁，尤其是Beta-lactam类抗生素，包括肠道菌属对Carbapenem类抗生素之药敏试验等。

3 抗菌药物敏感性试验质量控制标准

CLSI制定了一系列关于抗菌药物敏感性试验质量控制标准文件。例如：

M2抗菌药敏试验的性能标准；

M6脱水Mueller Hinton琼脂的评价方法；

M7有氧培养的细菌稀释抗生素敏感性试验方法；

M11厌氧菌的药敏试验方法；

M23维生素E检测标准及质量控制参数的研究进展；

M39累积抗生素敏感性试验数据的分析和介绍；

M21血清杀菌试验方法学研究；

M24分枝杆菌、Nocardia和其他有氧放线菌的药敏试验；

M26抗菌药物杀菌活性测定方法；

M27酵母菌稀释液抗真菌药敏试验的参考方法；

M31抗菌菌的性能标准和动物分离细菌的稀释敏感性试验；

M37兽用抗菌药物易感性检测标准及质量控制指标的研究进展；

M38肉汤稀释法丝状真菌药敏试验的参考方法；

CLSI，M7-稀释的方法抗生素敏感性测试有氧生长的细菌；批准的标准(最近批准的补充)；

CLSI，M11-厌氧细菌的抗菌药敏试验方法；批准的标准(最近批准的补充)；

CLSI，M100-抗菌药敏试验的性能标准。(最近的信息补充)；

CLSI，M23-体外药敏试验标准和质量控制参数的制定；批准的指南(最近批准的补充)；

M2——即纸片扩散法(DD)描述了如何执行纸片扩散散测试文件M2-A11；

M7即MIC文件，描述如何对需氧菌进行最小抑菌浓度(MIC)试验M7-A9。

利用CLSI M2-A11 M7-A9操作药敏试验，结果解释表参照M100-S26，M100包含用于解释纸片扩散法的表和MIC试验表，其中，M100每年更新一次；M2、M7每3年更新一次，以下举例说明M100-25、26、27的区别。

2016年CLSI M100-S26，更新了细菌抗生素敏感性报告判读标准，主要变动包括以下：

一是针对大肠埃希菌(E.coli)、克雷伯菌属(K.pneumoniae)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)三只常见之肠内菌(Enterobacteriaceae)，新增尿道感染尿液样本对Cefazolin药物的判读标准(表1)。因实验室无法判定病人临床诊断是否为尿道感染，因此会同时出现以下两种判读标准CZ(其他)及CZ(尿液)。临床医生根据病人临床诊断及送验类别进行判读。二是肠内菌(Enterobacteriaceae)于Cefepime的判读标准变动如下(表2)，报告格式由I(intermediate)变为SDD(susceptible-dose dependent)，判读为SDD的结果将以「D」格式核发。

表1 三只常见肠内菌判读标准的变化

表2 肠内菌判读标准的变化

三是不动杆菌属(Acinetobacter spp).于Imipenem的判读标准变化如下(表3)。

四是假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)对于Oxacillin药物敏感性试验方法变化。

当菌株生长状况不好时，VITEK2自动化药敏试验无法判读时，需要以disk diffusion方法进行测试。S.pseudintermedius由30μg Cefoxitin(surrogate test for Oxacillin)更改为1μg Oxacillin disk diffusion。变化前后标准如下(表4)。

表3 肠内菌判读标准的变化

表4 假中间葡萄球菌判读标准的变化

五是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)对于Piperacillin-tazobactam(TZP)药物敏感性试验判读标准变化如下(表5)。

另外，因CLSI已于2010年修改Cefazolin、Cefuroxime、Cefotaxime药敏判读标准；Cefepime判读标准也于2014年进行更改，上述四种抗生素药敏试验的判读标准更为严谨，可取代ESBL报告，且自2010年CLSI也不需再报告ESBL结果，所以删除ESBL字段。

表5 绿脓杆菌判读标准的变化

同时，Streptococcus agalactiae不再用于核发Erythromycin药敏试验结果：因CLSI与美国CDC等机构均建议Erythromycin不适用于Streptococcus agalactiae的治疗。

ISO/TC212也制定了相关质量控制ISO16256描述了一种检测酵母抗真菌剂敏感性的方法，包括引起感染的念珠菌和新生隐球菌。描述的参考方法尚未用于研究双态真菌的酵母形式，如皮炎杆菌和/或荚膜变种荚膜。ISO 16256描述了肉汤微稀释参考方法，该方法可以通过两种途径之一实现。一条途径涉及MIC的可视测定(CLSI法)，第二条途径涉及MIC的分光光度测定(EUCAST法)。

ISO 16256给出了MIC值的解释，指出酵母抗真菌剂通过肉眼确定MIC的方法也是基于CLSI最新出版指南，而通过光度法确定MIC的方法宜使用来自EUCAST最新折点解释。

ISO 16256给出了质量控制的标准。指出试验结果的质量应通过伴随使用的质控菌株(见表6和表7)来监测。储存质控菌株应冻干或冷冻保存(肉眼判读法-70℃保存，光度判断法-60℃保存)。质控菌株的工作培养物可通过储存菌株在非抑制性琼脂培养基上转种培养获得。工作培养物只能从第一代工作培养物传代，定期用从冷冻供应中制备新的斜面培养，至少每两周进行一次。如可能，每个测定日宜至少选取两株相关类型的质控菌株和日常标本按同样方式试验，且各质控菌株对各抗真菌剂的MIC检测结果应该在表6和表7规定的范围内。如果遇到超出质控值，宜首先重复试验以确定程序的关键步骤是否很好控制。如果还继续观察到失控值，应认真检查程序的所有方面。并且进一步参考测试应暂停直到质控值再回到正确的范围。

4 抗菌药物敏感性试验结果临床应用讨论

医生可根据药敏试验决定某种抗生素不能使用，不能根据药敏试验结果向医生推荐使用何种抗生素。每种药物都有自己的抗菌谱，在开发研究时，就确定了它的抗菌范围。刚投入使用时，抗菌谱范围内的细菌一般都是敏感的，随着使用时间的延长及滥用，细菌就产生了耐药性。如果不做药敏试验，医生只能根据以往的经验用药，往往误用已耐药的抗生素进行治疗而导致失败。所以，药敏试验的目的是合理选用抗生素、提高疗效、防止抗生素的滥用和误用。

体外药敏试验和体内药物疗效确实有差异，主要是因为体外和体内的环境不同。导致差异原因有多种。一是病原菌鉴定不正确或者一些混合感染的病原菌没有明确鉴定。一般医院临床微生物实验室的标本分离培养和细菌检验大多局限于需氧非苛养菌，而对于一些对氧或营养有特殊要求的细菌如厌氧菌和苛养菌，由于分离培养较困难，故未能获培养和鉴定。二是会存在有正常菌群存在的部位，如呼吸道。

表6 肉眼判读肉汤微量稀释试验两个质控菌株的24h和48hMIC(mg/L)推荐限值

表7 光度判读肉汤微量稀释试验质控菌株的MIC推荐限值

要选择合适的药敏试验方法。药敏试验方法选择不当会导致药敏结果的不正确。例如，对于CLSI规定药敏试验必须用稀释法(MIC法)测定的菌株，如许多不发酵糖革兰阴性菌，如果采用纸片扩散法测定，其结果可能会不能正确反映菌株对抗菌药物的敏感性。对抗菌药物的敏感性试验不同国家或有不同的判断标准。某些耐药细菌体外药敏试验结果是敏感的，但临床治疗或许无效。