几种菌的外排泵系统及其抑制剂

黄娇 编译，穆青 审校

(复旦大学药学院，上海 200000)

20世纪出现了许多能成功预防与控制感染性疾病的方法，然而人们却误认为对抗感染性疾病的战争已经结束。在20世纪80年代，药企普遍认为货架上有足够的抗生素，因此，他们将研究的精力转移至别处。当新的流感病毒爆发以及耐药病原菌再次出现时，发现这种乐观态度只是暂时的。超级细菌，即几乎对所有抗生素产生抗药性的细菌，对人类健康造成巨大威胁。每年在全世界范围内超过一千三百万人死于新的感染性疾病或者先前被认为容易控制的二次感染。Christina Kourtesi等在期刊The Open Microbiology Journal, 2013, 7 (Suppl 1-M3): 34-52发表了题目为Microbial Efflux Systems and Inhibitors:Approaches to drug discoveryand the challenge of clinical implementation的综述文章，我们通过编译其前半部分内容介绍细菌的外排泵耐药系统。

多药外排作用是致使多种抗生素以及化学治疗药物对细菌无效的一个主要原因。外排作用来源于膜转运蛋白的活性，这种蛋白即为多药外排系统。多药外排系统在细胞代谢过程中非常重要，并且在膜拓扑、能量耦合机制以及底物特异性方面的作用各有不同。鉴定天然底物和外排系统抑制剂需要积极而有拓展性的研究课题。基于序列的相似性，外排系统被划分为以下六个超级家族(图1)：ATP结合盒(ABC)、多药及毒性化合物外排(MATE)、耐药节结化细胞分化家族(RND)、小多重耐药性家族(SMR)、多种抗生素外排蛋白家族以及多药核内体转运家族(MET)。前5个家族存在于微生物中，而MET家族似乎仅限于高等真核生物。所有家族的代表成员都在哺乳动物细胞中表达。ABC转运体是最大的超级家族，基于其序列及结构的同源性，可将其分为A～G等7个亚家族。

转运底物识别的分子机制、动力学、化学计量学以及反转运的特点是一直在持续进行的研究领域。结构研究表明，转运体可直接从周质或者细胞质膜的外部leaflet与底物结合。回顾一下，药物转运过程包括几个具体的关键步骤，即分子内和分子间构象变化以及分子间动力学的相互作用；需要晶体学、分子建模、分子生物学、能量计算和生物功能调查等多方面学科的协同作用，才能理解药物转运过程。由于一些药物转运蛋白有协同作用或者能够按顺序发挥作用，使得这些作用情形显得更加复杂。

由于RND以及ABC外排系统在反向转运以及能量依赖性外排方面存在机制差异，有关RND以及ABC外排系统中的药物运输具有根本性的挑战，即广泛的特异性或称多特异性。区分“单一”结合步骤以及在具有活性构象的高亲和力口袋中正确识别结合很困难，这种结合可有效地将药物转运到外膜通道。包括分子对接计算在内的结构数据虽然提供了一些信息，但是没有生物学支持，远远达不到模型开发的程度。能量来源是运输功能以及底物识别的关键因素，至少质子反转运外排是一个PH依赖过程，这也是研究各种病原体的一个热门领域。

为了克服外排作用对化学治疗的阻碍，①改进旧的抗生素分子设计以减少外排以此绕开外排系统。②通过直接修饰减少隔膜功能，或者减少外膜通道造成“交通阻塞”的通道阻滞剂的功效，实现细胞内药物的高浓度贮存。③阻断外排能力，通过竞争或非竞争抑制，反向转运位点的直接或间接的能量消耗，细菌细胞胞外被膜能量驱动机制的瓦解。

通过对感染和肿瘤多种靶标提供活性结构骨架，天然产物在药物发现中扮演了重要角色。运用天然产物作为外排系统抑制这一战略出现在近十年。全新的和已知的天然化学分子实体的活性涵盖了几乎所有的主要微生物外排系统，这些报道遍布化学领域和其它文献。通过使用外排抑制剂恢复和提高抗菌素功用是吸引人的，但迄今为止还未进入使用状态。发现外排抑制剂的努力在多角度和深入展开，但很多概念和方法上的缺口依然阻碍着先导外排抑制剂进入临床运用。本综述重点对植物来源的外排泵抑制剂发现和确证的工具及其特点进行了总结，同时大致描述了它们的进一步发展和临床应用发展之路。

1 革兰阳性菌中的多药外排系统

与革兰阳性菌耐药性相关的主要外排系统为染色体编码的MFS家族，包括NorA，NorB，NorC以及MdeA；MATE家族，如mepRAB(多药外排蛋白)；SMR家族，如SepA。另外，也存在质粒编码体系，如QacA，QacB以及Tet(K)，这些体系具有四环素-二价金属络合物/H+反转运体功能。NorA同系物(EmeA)也已经在粪肠球菌中得到验证。这些系统均具有广泛的、重叠的底物特异性，具体包括喹诺酮，四环素，单价和二价抗微生物阳离子(插层染料，季铵化合物，联脒，双胍)和植物次生代谢物，见表1。

2 革兰阴性菌中的多药外排系统

多重耐药(MDR)和泛耐药(PDR)革兰阴性菌使得感染真正无法治愈，对人类生命构成了严重的威胁。外排系统是各种具有挑战性的临床感染的关键角色。耐药-节结化细胞分化家族(RND)包括在大肠埃希菌中以AcrAB-TolC为主要成员的质子驱动系统，它们在弗氏木兰弧菌(Francisella tularensis)、耶尔森菌(Yersinia pestis)和布鲁杆菌(Brucella)属中具有强同源性，AcrB是与外膜通道TolC和膜融合蛋白AcrA相关联的多亚单位复合物。在铜绿假单胞菌中存在12种RND型外排系统，其中MexAB-OprM，MexCD-OprJ和MexXY-OprM已被证明对β-内酰胺类和氟喹诺酮类有耐药性(另外还有MexEF-oprN)。虽然已经建立了与氨基糖苷类抗生素、抗菌肽和生物膜形成相关的耐药外排划分体系，但是这只是复杂的细胞反应的一部分。最近分析了新增加的RND类型系统的特点，包括MexABC-OpmB和一种三氯生外排泵TriABCOpmH(MexABC-OpmB和TriABC-OpmH均为新增加的RND类型系统)。铜绿假单胞菌中的mex-locci与3个关键病原体的同源系统具有系统发生相关性。

图1 微生物外排系统中5个超级家族关键成员的示意图

2.1 Bpe-外排系统

伯氏假单胞菌(Bulkhoderia pseudomallei)以及鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)中的11个Bpe-外排系统。BpeAB-OprB是一种广谱多药外排系统，仅在低水平表达，只对多重耐药有微弱的贡献。相反，表达BpeEF-OprC的菌株对于大多数临床有用的抗疟疾抗生素具有高度抗药性。

2.2 Bme-外排系统

存在于新洋葱伯克霍尔德菌(B.cenocepacia)中的16种RND外排系统(Bcc复合物，RND-1至-16)以及脆弱拟杆菌中的Bme(ABC1-16)。至少有七种BmeB外排泵在转运抗微生物药物方面起着重要作用，并且具有相互交叠的底物，另外至少有四种具有固有抗药性。

2.3 Ade RND系统以及ABC外排系统

在鲍曼不动杆菌中至少有5种Ade RND系统具有完全的功能特征，其中包括AdeIJK，AdeSR-adeABC，AdeDE和AdeFGH。

ABC外排系统已经在多种情况下被证实，包括黏质沙雷菌中的杂二聚体SmdAB和大肠埃希菌大环内酯转运体MacAB，MacAB在尼日利亚淋病中也得到了验证。

一些具有外排能力的MFS存在于革兰阴性菌，其中包括肠系膜沙门菌Typhimurium SmvA基因，(极其类似于金黄色葡萄球菌的QacA)，大肠埃希菌的EmrAB-TolC以及在大肠埃希菌和克雷伯菌[44]中涉及喹诺酮耐药性的QepA和OqxAB质粒，但MFS在肠杆菌科中分布广泛。鲍曼不动杆菌中的外排泵CraA与大肠埃希菌的MdfA同源，氯霉素和获得性窄谱系统TetA，TetB，CmlA和FloR对鲍曼不动杆菌中的CraA无效。AmvA调节着鲍曼不动杆菌对抗菌和消毒作用的耐药性。SMR和MATE家族的成员已经在各种革兰阴性菌中被检测到。AbeM和AbeS已经在鲍曼不动杆菌中确定特征，不动杆菌属其它种的AdeXYZ，AdeDE和QacE也是如此，SugE在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)中具有抗菌素耐药性，见表2。

3 分枝杆菌中的多药外排系统

分枝杆菌复合物具有相当多样化的外排系统，它们是MFS或者ABC超级家族成员。相比于基因组大小，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)被公认为是具有最大的药物外排泵数量的菌种之一。生物信息学以及直接和间接证据已经确定了药物外排与结核分枝杆菌固有耐药性或者获得耐药性之间的关系。Tap是第一个鉴定出的MFS系统，Rv1258在结核分枝杆菌基因组的注释序列中。已经鉴定的转运蛋白与其他生物组织鉴定出的蛋白质之间的基因组分析和同源检索，揭示了属于MFS的编码公认的药物外排泵的16个开放阅读框，包括序列Rv0849在内至少三个被证明有药物外排功能。这一列表正在扩展，包括ABC超家族成员，如DrrAB、Bcg0231(牛分枝杆菌BCG)、Rv0194、Rv1218c、Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c和SMR系统Rv3065，耻垢分枝杆菌中的LfrA，以及结核分枝杆菌的同源物Rv1145、Rv1146、Rv1877、Rv2846c(efpA)和在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中的Rv3065(mmr和emrE)。

表1 临床常见革兰阳性菌的外排系统

表2 临床常见革兰阴性菌和结核杆菌的外排系统

4 真菌中的多药外排系统

真菌多药外排系统得以最好研究的家族来自酿酒酵母，特别是那些多效药耐药(PDR)菌株。这个家族的成员是高度保守的，并且通常是致病真菌物种产生耐药性的来源。虽然真菌细胞含有两种类型系统的许多基因，一类为管家基因，一类为奢侈基因，但临床唑类耐药性通常与ABC转运体的过度表达有关。临床上重要的PDR转运体包括白念珠菌Cdr1p(CaCdr1p)和CaCdr2p，它们是酿酒酵母Pdr5p(ScPdr5p) 和哺乳动物G型ABC转运体的同系物。真菌PDR外排系统具有相对较杂的底物特异性，可能是由于其跨膜结构域的底物特异性。通过分析白色念珠菌基因组鉴定了几种属于ABC超家族的外排泵(CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、SNQ2和YOR1)。表1和表2列举了一些临床常见的几种菌的外排系统。

5 结语

由于抗生素的滥用，细菌对临床所使用的几乎所有抗生素产生了耐药性，新的抗菌药物的研发越来越具有挑战性，因此，如何应对耐药菌感染是目前亟需解决的一大难题。研究表明，由外排泵介导的耐药性较为普遍，且大部分外排泵在结构上具有同源性，有助于发现对不同细菌的不同外排泵具有广泛抑制作用的外排泵抑制剂。另外，细菌外排泵的种类繁多，作用机制复杂，因此需要对细菌外排泵的结构以及作用机制等进行深入研究，以克服细菌耐药性，将外排泵抑制剂与抗生素联用的策略提高抗生素的效用。