骨康胶囊组方药物对成骨细胞SaOS-2增殖分化及矿化的影响*＊

2019-03-12沈艳珍李勇军席晓岚

贵州医科大学学报 2019年2期

杨健，李靖，彭潇，董莉，沈艳珍，李勇军，席晓岚＊＊，刘亭＊＊

(1.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳 550004;2.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550025;3.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳 550004;4.贵州维康子帆药业股份有限公司，贵州修文 550200)

成骨细胞(osteoblasts，OB)是骨组织中的重要细胞，起源于具有多向分化潜能的骨髓间质细胞，主要作用是负责骨基质的合成、分泌，参与骨矿化。体外培养的成骨细胞是进行抗骨质疏松新药筛选和药效学评价的重要模型［1－3］。骨康胶囊是由补骨脂、续断、三七、芭蕉根、酢浆草组方而成的中药复方制剂，治疗骨质疏松有较好疗效，且补骨脂是治疗骨质疏松症的常用药物，为历代医家广泛应用于各类补肾健骨方，有调节骨转化，促进成骨细胞增殖等活性［4－5］。本实验室前期研究发现骨康胶囊中的补骨脂和酢浆草成分对体外培养的成骨细胞的增殖、分化和矿化有促进作用［6－7］，为进一步了解骨康胶囊的促骨形成作用机制，本实验以骨康胶囊处方中的其他三味药材续断、三七和芭蕉根为研究对象，以成骨细胞的增殖、分化和矿化为指标，观察组方中的单味药材对成骨细胞SaOS-2增殖、分化和矿化的影响，为骨康胶囊的组方优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂 SaOS-2人成骨肉瘤细胞株购自武汉普诺赛科技生物有限公司，McCoy’s 5a培养基购自上海生工生物工程股份有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青－链霉素，购自美国Gibco公司，碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，Triton X-100、噻唑蓝(MTT)购自Solarbio公司，BCA蛋白定量试剂盒、哺乳动物蛋白抽提试剂盒均购自中国康为世纪公司，茜素红购自sigma公司，人骨钙素(OTC)ELISA试剂盒、人钙离子(Ca2+)ELISA试剂盒均购自上海蓝基公司。

1.1.2 仪器 EL204电子天平(上海梅特勒－托利多仪器有限公司)，CO2细胞培养箱(美国Thermo scientific公司)，TS-100F荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)，Allegra 64R冷冻高速离心机(美国Beckman公司)，680型酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人成骨肉瘤细胞SaOS-2用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素－链霉素的McCoy＇s 5a培养基，在 37 ℃，5%CO2培养箱中培养，将细胞分为对照组及芭蕉根、续断、三七给药组，在SaOS-2细胞增殖实验中，给药组分别以1、10、100、200、400 和 800 mg/L 芭蕉根、续断、三七作用于SaOS-2细胞，对照组加入不含药培养基。

1.2.2 药物配制芭蕉根、续断、三七提取物由贵州维康子帆药业股份有限公司提供，用DMSO配制成含芭蕉根、续断、三七生药量为1 g/mL的溶液，于－20℃保存备用，实验时用培养基稀释至相应的终浓度(DMSO含量小于5‰)。

1.2.3 SaOS-2细胞增殖检测采用MTT法。取对数生长期各组SaOS-2细胞接种于96孔板，1×104个/孔，每组5孔，培养24 h后换液;继续培养48 h后，加入MTT液20μL，继续培养4 h;弃去培养液后加DMSO 100μL/孔，于490 nm波长检测各组吸光度值。

1.2.4 SaOS-2细胞ALP活性测定取对数生长期的SaOS-2细胞接种于24孔板，10×104个/孔。培养24 h后，各给药组更换为含生药浓度的终浓度分别为10、100及200 mg/L的培养基，对照组为不含药培养基，每个浓度5孔;继续培养48 h后，弃上清培养液，培养板用PBS清洗2遍，每孔加入200 μL 0.1%Triton X-100，于冰上裂解10 min，取上清液，用ALP试剂盒测定细胞ALP活性，并用BCA试剂盒测定细胞裂解液中的蛋白质含量。用碱性磷酸酶/蛋白总浓度表示ALP的活性。

1.2.5 SaOS-2细胞Ca2+和OTC检测采用ELISA法。取对数生长期的SaOS-2细胞接种于24孔板，10×104个/孔;培养24 h后，更换为各组含药培养基，药物浓度同1.2.5，每组5孔;培养48 h后弃培养液，用PBS洗涤2次，加入哺乳动物蛋白抽提试剂200μL，冰浴10 min。取上清液按人钙离子ELISA试剂盒和人骨钙素ELISA试剂盒说明分别测定细胞Ca2+和OTC含量。

1.2.6 SaOS-2细胞矿化结节数测定采用茜素红染色法。取对数生长期的SaOS-2细胞接种于24孔板，30×104个/孔，培养24 h后，更换为各组含药培养基，药物浓度同1.2.5，每组5孔，隔天更换一次培养基，连续观察2周，待形成大量的矿化结节后，弃培养液，加PBS清洗2遍，95%乙醇固定10 min，蒸馏水洗涤3次后，加pH 8.3的0.1%茜素红-Tris-HcL染色30 min，蒸馏水洗涤、干燥，最后于显微镜下观察各孔矿化结节的数目。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 18.0软件进行处理，结果用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SaOS-2细胞增殖

与对照组比较，芭蕉根水提物浓度在1～800 mg/L时SaOS-2细胞增殖活性无明显变化(P＞0.05)。续断水提物浓度在10～200 mg/L时能显著增高SaOS-2细胞增殖活性(P＜0.01)，浓度为200 mg/L时，增殖促进作用达最大，浓度至800 mg/L时，SaOS-2细胞的增殖被明显抑制(P＜0.01)。三七水提物浓度在1～400 mg/L时对SaOS-2细胞增殖活性无明显影响(P＞0.05)，浓度至800 mg/L时，SaOS-2细胞的增殖被明显抑制(P＜0.01)。见表1。

表1 骨康胶囊组方中续断、芭蕉根及三七对SaOS-2细胞增殖的影响( ± s，n=5)Tab.1 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on Saos-2 proliferation

(1)与对照组比较，P＜0.01

组别细胞增殖(%)续断芭蕉根三七对照组100.00±0.53 100.00±0.53 100.00±0.53 1 mg/L组 99.88±0.33 99.99±0.75 101.54±0.98 10 mg/L组 106.00±0.64(1)100.01±0.15 98.35±0.74 100 mg/L组 115.431±0.67(1)100.01±0.51 99.88±0.57 200 mg/L组 118.39±0.56(1)98.89±0.46 101.78±0.74 400 mg/L组 105.39±0.56(1)100.09±0.67 99.03±0.66 800 mg/L组 94.11±0.65(1)97.01±0.53 91.78±0.74(1)

2.2 SaOS-2细胞ALP活性

由MTT检测结果可知，续断及三七水提物组SaOS-2细胞的增殖随着药物浓度的增大而受到明显抑制，故以10、100和200 mg/L为各实验组的低、中、高浓度，检测SaOS-2细胞 ALP活性，结果显示，与对照组比较，续断水提物组的低、中、高浓度能提高ALP水平(P＜0.05或P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高浓度对 SaOS-2细胞ALP水平无明显影响(P＞0.05)。见图1。

图1 骨康胶囊组方中不同浓度续断、芭蕉根及三七对SaOS-2细胞ALP活性的影响Fig.1 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on ALP activity of Saos-2 proliferation

2.3 SaOS-2细胞Ca2+和OTC

Ca2+检测结果表明，与对照组比较，各浓度的续断水提物对SaOS-2细胞Ca2+的分泌有非常明显的促进作用(P＜0.01)，芭蕉根、三七水提物的低、中、高浓度对SaOS-2细胞钙离子分泌均无明显影响(P＞0.05)，见表2。OTC检测结果表明，与对照组比较，续断水提物低浓度组对SaOS-2细胞OTC分泌无明显影响，中、高浓度组可增加SaOS-2细胞OTC分泌(P＜0.05或P＜0.01);三七水提物低、中浓度组对OTC分泌无明显影响，高浓度有明显促进OTC分泌的作用(P＜0.05);芭蕉根水提物各浓度对OTC分泌无明显变化，见表3。

表2 骨康胶囊组方中不同浓度续断、芭蕉根及三七对SaOS-2细胞Ca2+分泌的影响( ± s，n=5)Tab.2 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)与对照组比较，P＜0.01

组别 Ca2+(μg/L)续断芭蕉根三七对照组25.25±1.47 25.25±1.47 25.25±1.47 10 mg/L组 80.59±6.97(1)23.81±2.75 25.49±2.73 100 mg/L组 178.66±6.43(1)24.15±1.67 26.11±2.41 200 mg/L组 140.72±5.81(1)26.04±1.98 28.26±3.10

表3 骨康胶囊组方中不同浓度续断、芭蕉根及三七对SaOS-2细胞OTC分泌的影响( ± s，n=5)Tab.3 The Effects of Dipsacus asper，Panaxnotoginseng and Musa basjoo Sieb on OTC secretion

与对照组比较，(1)P＜0.05，(2)P＜0.01

组别 OTC(μg/L)续断芭蕉根三七对照组11.41±0.63 11.41±0.63 11.41±0.63 10 mg/L组 13.58±0.75 10.98±0.63 11.50±0.49 100 mg/L组 14.58±0.69(1)11.78±0.57 12.36±0.61 200 mg/L组 15.32±0.76(2)12.78±0.48 14.29±0.44(1)

2.4 SaOS-2细胞矿化结节数

培养2周后，各给药组细胞矿化结节染色结果呈阳性。与对照组比较，续断水提物中、高浓度组的矿化结节数目明显高于对照组(P＜0.05)，而续断水提物低浓度组和三七、芭蕉根水提物的各浓度组对矿化结节数目形成无明显影响(P＞0.05)。见表4。

表4 骨康胶囊组方中不同浓度续断、芭蕉根及三七对SaOS-2细胞矿化结节形成的影响( ± s，n=5)Tab.4 The Effects of Dipsacus asper，Panax notoginseng and Musa basjoo Sieb on Ca2+secretion

(1)与对照组比较，P＜0.05

组别矿化结节数(n)续断芭蕉根三七对照组4.20±0.60 4.20±0.60 4.20±0.60 10 mg/L 6.08±0.49 3.80±0.36 5.50±0.66 100 mg/L 8.92±0.58(1) 4.80±0.55 4.36±0.45 200 mg/L 10.10±0.37(1)3.91±0.46 6.00±0.74

3 讨论

中药复方是传统中医朴素的系统思想的产物，通过不同药物之间的配伍产生不同的疗效，且各药物的剂量不同，也有可能会表现出不同的药效。因此，在组方优化过程中，探明复方药物中某一药效起作用的主要药物显得尤为重要。

MTT法表明，在浓度小于800 mg/L时，续断水提物对成骨细胞增殖有很明显的促进作用，而芭蕉根与三七水提物作用不明显;而较高浓度(800 mg/L)时，各给药组SaOS-2细胞的增殖被明显抑制，说明各给药组高浓度对于成骨细胞可能具有一定的毒性。这可能是因为高浓度的药材水提物中，对细胞产生毒性的有关成分含量也有所增加。

ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白，与细胞成熟及骨的钙化作用密切相关，被认为是细胞外基质成熟的早期标志;OTC是由成骨细胞合成和分泌的一种活性多肽，是骨质钙化必需的因子，起到维持骨组织正常矿化的作用［8－9］。因此，ALP和OTC分别是成骨细胞早期和中期分化的标志物［10］。与对照组比较，续断水提物各浓度均能显著增加ALP的活性，且能有效的促进OTC的分泌，与程志安等［11］的研究结果一致;三七水提物除了高浓度对成骨细胞OTC的分泌有明显的促进作用外，其余浓度对ALP活性及OTC的分泌作用与对照组相比差异均无统计学意义，而吴丽萍等［12］的研究表明三七总甙可促进成骨细胞的增殖和分化，这可能是由于三七水提物中的三七总甙含量不高所致。类似的，在细胞Ca2+分泌的检测中，续断水提物各浓度对Ca2+分泌有明显的促进作用，而三七、芭蕉根水提物与对照组相比无明显差异。矿化结节的形成是成骨细胞分化的最后阶段，包括胶原的沉积和基质的矿化两个步骤。被认为是成骨细胞分化成熟的晚期标志［13］。培养2周后，各给药组矿化结节染色结果呈阳性;与对照组比较，除芭蕉根水提物外，各组均有增加成骨细胞矿化结节的趋势。

综上所述，骨康胶囊组方中的续断可以显著促进体外培养的成骨细胞SaOS-2的增殖、分化和矿化。结合之前的研究，提示续断、补骨脂和酢浆草可能为骨康胶囊促成骨细胞骨形成的主要作用药物，而三七及芭蕉根在骨康胶囊抗骨质疏松中的作用有待进一步研究。