汉防己碱衍生物诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡*＊

黄晏军，汤长宁，杨 爽，潘卫东，刘杰麟＊

(1.贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳 550004;2.贵州医科大学组织工程与干细胞中心，贵州贵阳 550004;3.贵州省天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550004)

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率的29%，其中三阴性乳腺癌是不表达雌激素受体、人表皮生长因子受体-2(HER2)和孕激素受体的恶性肿瘤，该类乳腺癌治疗预后差、复发转移率高、死亡率较高，已成为近年来科研学者研究的焦点。由于三阴性乳腺癌患者缺少相应受体的表达，因此患者无法从针对乳腺癌的靶向治疗中获益。化疗是目前较常用的治疗方法，许多新型的化疗药物也正在研究之中［1－2］。汉防己碱又名汉防己甲素，属于双苄基易喹啉类生物碱，是一种由粉防己的根部提取的中药成分，早期的研究表明汉防己碱具有抗感染，镇痛等多种临床功效，临床用于治疗心血管疾病、矽肺和免疫性疾病等［3］。除此之外，汉防己碱衍生物的功效也在研发探索过程中，部分衍生物在抑制肿瘤细胞生长方面有良好的效果。BLM解旋酶参与了DNA复制、重组、损伤修复等一系列过程［4］。乳腺癌易感基因1(BRCA1)主要参与了DNA损伤修复信号通路的调节［5］。课题组前期研究发现汉防己碱衍生物能够调节DNA损伤修复信号通路，抑制乳腺癌细胞的生长，如汉防己碱衍生物P-42、汉防己碱衍生物HL-42和汉防己碱衍生物HL-49均能诱导人乳腺癌细胞凋亡，其机制可能与DNA损伤修复相关蛋白表达有关［6－7］。本文将探讨汉防己碱衍生物YZ-18对MDAMB-231细胞增殖和诱导的影响，并探讨其诱导凋亡的机制，以寻找药物治疗三阴性乳腺癌的新途径，为新型抗肿瘤药物的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

汉防己碱衍生物YZ-18由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供。DMEM高糖培养液购自HyClone公司，细胞培养用的胎牛血清购自天杭生物科技公司，MTT试剂购自索莱宝科技公司，细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI双染)购自天根生化科技公司，一抗(兔抗人β-actin单克隆抗体、BLM多克隆抗体、BRCA1多克隆抗体)以及二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体)购自博奥森生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 TNBC MDA-MB-231细胞保存在贵州医科大学组织工程与干细胞研究中心，使用含有10%胎牛血清、1%双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)的高糖DMEM培养液，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中进行培养。

1.2.2 MDA-MB-231细胞增殖检测 采用MTT法检测MDA-MB-231细胞增殖情况。取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于96孔板(按照每孔2.5×104个细胞)，待细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用细胞(药物终浓度为0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)。分别培养1、2和3 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20μL，于培养箱中孵育4 h，弃上清液后，每孔加入 DMSO 150μL溶解结晶，采用酶标仪测定各药物处理组吸光度(OD值)，每组设3个复孔，实验独立重复3次，并计算各药物处理组细胞的增殖抑制率［细胞增殖抑制率=(对照组OD－实验组OD)/对照组OD)×100%］，并计算不同浓度汉防己碱衍生物YZ-18作用不同时间的半数抑制浓度(IC50)值。

1.2.3 MDA-MB-231细胞克隆形成能力检测 集落形成实验检测MDA-MB-231细胞克隆形成能力。取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于24孔板(按照每孔3×102个细胞)，待细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用细胞(终浓度为 0、0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L)。药物作用2 d后换为正常培养液继续培养。7 d后终止培养，弃上清液后，甲醇溶液固定细胞，行Giemsa染色，倒置显微镜下观察集落生长情况，每组设3个复孔，实验独立重复3次，并计算各药物处理组细胞集落形成数目。

1.2.4 MDA-MB-231细胞的凋亡检测 流式细胞术检测MDA-MB-231细胞的凋亡情况。取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板(按照每孔2×105个细胞)，待细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用细胞(终浓度为0、1、8μmol/L)。药物作用2 d后，收集各药物处理组细胞，先加入Annexin V-FITC染色液避光染色后，再加入PI染色液避光染色，染色后立即用流式细胞仪检测各组的凋亡率，每组设3个复孔，实验独立重复3次。

1.2.5 MDA-MB-231细胞中BLM、BRCA1蛋白表达水平检测 Western blot法检测MDA-MB-231细胞BLM、BRCA1蛋白表达水平。汉防己碱衍生物YZ-18作用后取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板(按照每孔2×105个细胞)，待细胞贴壁生长后，分别加入不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用细胞(终浓度为0、1、8μmol/L)。作用2 d后，收集各药物处理组细胞，裂解液冰上裂解细胞，提取总蛋白，并测定蛋白浓度。经 SDSPAGE电泳后湿法转膜，与兔抗人 β-actin、BLM、BRCA1抗体4℃孵育过夜，与二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体)37℃孵育2 h，加入 ECL化学发光试剂后立即使用化学发光仪检测蛋白条带，每组设3个复孔，实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

以上实验均独立重复3次。应用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料多组间比较采用方差分析，组内比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉防己碱衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231细胞的增殖活性

分别用不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用MDA-MB-231细胞1、2和3 d后，通过MTT法检测细胞的增殖活性。结果显示，与对照组相比，用不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18(药物终浓度为 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)作用 MDA-MB-231 细胞1、2和3 d后均能抑制细胞的增殖(P＜0.05)，且呈现药物浓度和处理时间依赖性，见图1。YZ-18作用MDA-MB-231细胞24、48、72h的IC50值分别为(3.89 ±0.27)、(2.97 ±0.34)、(1.59 ±0.13)μmol/L。

图1 YZ-18对MDA-MB-231细胞增殖的影响Fig.1 The effect of YZ-18 on the proliferation of MDA-MB-231 cells by MTT assay

2.2 汉防己碱衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231细胞的克隆形成能力

分别用不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用细胞2 d，继续培养1周后，通过平板集落形成实验检测各药物浓度组MDA-MB-231细胞的集落形成数量。结果显示，与对照组相比，不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18(药物终浓度为0.25、0.5、1、2.5μmol/L)干预MDA-MB-231细胞后，各药物作用组集落数量均明显减少(P＜0.001)，且呈现出药物浓度依赖性。见图2。

图2 YZ-18对MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响(Giemsa，×400)Fig.2 The effect of YZ-18 on clone formation of MDA-MB-231 cells was detected by plate clone formation assay

2.3 汉防己碱衍生物YZ-18可促进MDA-MB-231细胞的凋亡

分别用不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用MDA-MB-231细胞2 d后，采用流式细胞仪观察各药物浓度组细胞的凋亡情况。结果显示，与对照组相比，不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18(药物终浓度为1和8μmol/L)干预MDA-MB-231细胞后，各药物浓度处理组MDA-MB-231细胞的凋亡率均明显高于对照组(P＜0.01)。且呈现药物浓度依赖性。见图3。

图3 YZ-18对MDA-MB-231细胞凋亡的影响Fig.3 The effect of YZ-18 on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 汉防己碱衍生物YZ-18对MDA-MB-231细胞中BLM、BRCA1蛋白表达水平的影响

分别用不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18作用MDA-MB-231细胞2 d后，采用Western blot法检测各药物浓度组 MDA-MB-231细胞中 BLM、BRCA1蛋白表达情况。结果显示，与对照组相比，不同浓度的汉防己碱衍生物YZ-18(药物终浓度为1和8μmol/L)干预MDA-MB-231细胞后，细胞中BLM蛋白表达上调，BRCA1蛋白表达下调，且呈现药物浓度依赖性。见图4。

图4 YZ-18对MDA-MB-231细胞中BLM、BRCA1蛋白表达水平的影响Fig.4 The effect of YZ-18 on protein expression of BLM，BRCA1 in MDA-MB-231 cells

3 讨论

汉防己碱作为传统的中药成分，目前临床上主要用于抗感染、镇痛、控制血压等［3］，大量研究表明，汉防己碱可以作为肿瘤化学疗法的一个潜在药物，汉防己碱能够抑制胃癌、结直肠癌、等多种恶性肿瘤细胞的生长，也陆续报道了在诱导细胞凋亡方面的部分作用机制。有探索发现，汉防己碱能够抑制结肠癌细胞异种移植后的生长［8］，通过激活胞内线粒体中Caspase相关蛋白途径来诱导胃癌细胞的凋亡［9］，发现汉防己碱可以作为细胞膜Ca2+通道阻断剂和Ca2+通道拮抗剂来抑制肿瘤生长［10］。汉防己碱可诱导成纤维细胞的凋亡，与此同时，在TGF-β引导心脏成纤维细胞激活的过程中，它还可以阻断其激活途径［11］。Tian 等［12］在研究汉防己碱干预人骨肉瘤细胞的增殖时发现汉防己碱主要是通过上调PTEN通路起作用。在研究汉防己碱诱导结肠癌细胞的凋亡时，He等［13］发现其机制可能与其调节Wnt/β-catenin信号通路有关，Chen等［14］发现可能与其调节 PI3K/Akt信号通路转导进而诱导结肠癌细胞凋亡。Zhang等［15］发现它在肝细胞癌体内转移方面起着关键的作用，可以干预细胞的转移。

本实验通过MTT实验检测发现，用1、2、4、8、16μmol/L汉防己碱衍生物YZ-18干预MDA-MB-231细胞1、2和3 d后均能抑制细胞的增殖(P＜0.05)。呈现药物浓度和处理时间依赖性。集落形成实验结果表明，汉防己碱衍生物YZ-18干预MDA-MB-231细胞2 d后，继续常规培养时细胞克隆形成能力明显减弱，且抑制效应呈现处理浓度依赖性。通过流式细胞术检测发现，汉防己碱衍生物YZ-18干预细胞后，可促进细胞的凋亡，且凋亡效应依赖药物浓度。以上实验结果表明，YZ-18能够有效抑制人三阴性乳腺癌细胞的生长，并诱导其凋亡。为了深入探讨YZ-18干预抑制MDA-MB-231细胞增殖的可能机制，本实验继续检测了BLM蛋白和BRCA1蛋白的表达。

DNA损伤普遍存在于真核细胞中，紫外线照射、电离辐射以及化学制剂等各种因素均能导致DNA损伤，其中最严重的是DNA双链断裂(DSB)。发生DSB后可引起细胞凋亡、细胞周期阻滞，此时胞内DNA损伤修复应答开始发挥作用［16］。人类RecQ DNA解旋酶家族中有 RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5等5种RecQ解旋酶，主要是维持细胞基因组的稳定［4］。BLM蛋白作为细胞内重要的DNA损伤修复酶，当基因因外力因素导致DNA双链发生损伤时，可以通过代偿性表达BLM解旋酶来发挥DNA损伤修复功能［17］。BRCA1作为DNA损伤修复信号通路的重要调节蛋白，能够维持基因组的稳定，主要是通过激活DNA损伤修复的调控点起作用［18］。比如在同源重组修复过程中，主要是通过以BRCA1为中心的复合物感知DNA损伤，继而引导同源重组修复的关键酶(Rad51)启动同源重组途径，对损伤的DNA进行修复［19］。除此之外，BLM 解旋酶、拓扑异构酶IIIα、RecQ介导的基因组不稳定蛋白1(RMI1)和RecQ介导的基因组不稳定蛋白2(RMI2)可以形成BTR复合物，该复合物与Rad51、BRCA1相互作用进而在同源重组修复过程中分解dHJ，修复DNA双链断裂［20］。总之，BLM蛋白和BRCA1蛋白均与DNA损伤修复有关。本实验发现，YZ-18干预乳腺癌MDA-MB-231细胞后，细胞中BLM蛋白表达量明显高于对照组，BRCA1蛋白明显低于对照组，表达水平明显依赖药物浓度。据以上实验数据推测，可能是由于汉防己碱衍生物YZ-18处理细胞后导致了胞内DNA的损伤，进而诱导DNA损伤修复应答，BLM蛋白通过表达上调，BRCA1蛋白通过表达下调，参与DNA损伤修复应答，同时引导相关凋亡信号的激活，引起细胞凋亡，抑制细胞增殖。

综上，本次实验发现汉防己碱衍生物YZ-18干预后，乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和集落形成能力均受到抑制，凋亡率增加。推测可能的机制是，汉防己碱衍生物YZ-18可以通过调节DNA损伤修复通路途径进而调控胞内凋亡信号通路的传导。因此本实验为汉防己碱衍生物YZ-18作为抗肿瘤新药的研发应用提供了可靠的研究证据。