气相色谱－质谱联用分析飞龙掌血根皮油的化学成分*＊

周 威，罗才荣，刘 刚，董伟强，张晓燕＊＊，沈祥春＊＊

(1.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550025;2.贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳 550025;3.浙江科强医药技术有限公司研发中心，浙江 宁波 315699)

飞龙掌血为芸香科植物飞龙掌血(Toddalia asiatica(L.)Lam.)的根或根皮，主要分布于贵州、广西等地，具有散瘀止血、祛风止痛等功效，临床上常用于治疗风湿疼痛、跌打损伤、伤口出血等疾患［1－4］。本课题组前期围绕飞龙掌血根皮的化学成分与止血活性，开展了一系列的研究工作［5－10］，运用以活性为导向的分离纯化手段、液相高分辨质谱联用分析技术、体内外活性评价相结合，证实天然香豆素类化合物是飞龙掌血根皮部位的主要药效成分，还发现飞龙掌血根皮中含有大量油类。虽然迄今为止，已有飞龙掌血挥发油的研究报道［11－13］，但是未见来源于飞龙掌血根皮的脂溶性油类化学成分的研究。为了全面考察飞龙掌血根皮止血活性的物质基础，本课题组利用GC-MS分析技术针对飞龙掌血根皮油的化学成分进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 Agilent 7890B-7000C气相色谱－三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent)，Greatwall R-1001-VN型旋转蒸发仪(郑州长城)，Greatwall SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城)，ZF-2型三用紫外分析仪(上海安亭)，SB-5200D型超声波清洗器(宁波新芝)。

1.1.2 材料 95%乙醇、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯(上海国药)，水为双蒸水(实验室自制)。飞龙掌血根皮药材采自贵州贵阳、都匀，经贵阳中医学院陈德媛教授、黔南民族师范学院郭治友教授鉴定为芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica的干燥根皮，标本存放于贵州医科大学药学院中药民族药标本馆。

1.2 方法

1.2.1 飞龙掌血根皮油的提取 干燥的飞龙掌血根皮药材粗粉35 kg，加3倍量95%乙醇冷浸提取9次，每次1周，合并冷浸提取液，减压回收溶媒，浓缩至无醇味浸膏。浸膏按1∶3加水溶解分散，依次用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、正丁醇萃取。合并石油醚萃取液，经过减压回收石油醚至无溶剂味，得到棕褐色浸膏油溶液;吸取其上层油作为此次研究的飞龙掌血根皮油贮存在茶色玻璃瓶内常温保存。

1.2.2 飞龙掌血根皮油的成分分析 气相色谱条件:HP-5MSUI(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)气相色谱柱，He作为载气，柱流量1 mL/min，分流比200∶1，进样口温度250℃，传输线温度280℃，进样体积1μL。程序升温:80℃初始柱温保持3 min，15℃/min升至260℃，保持5 min。GC-MS条件:EI电离方式，离子源温度230℃，四级杆温度150℃/150℃，溶剂延迟3 min，扫描模式 MS1 Scan，循环时间400 ms，扫描范围45～450 m/z，色谱信号采集时间3.0～20.0 min。NIST08谱库匹配未知峰，定性分析。采用峰面积归一化法计算各成分的相对百分含量。

1.2.3 溶液配制 空白溶剂对照样品:以乙酸乙酯作为空白对照，所得气相色谱图自动扣除乙酸乙酯色谱峰。飞龙掌血根皮油待测样品:精密移取20μL飞龙掌血根皮油样品置于EP管中，精密加入980μL乙酸乙酯，涡旋混匀，待进样分析。

2 结果

按上述GC-MS条件对飞龙掌血根皮油进行分析，得到飞龙掌血根皮油的总离子流图见图1。对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图，并将所得色谱峰的质谱信息经安捷伦GC-MS化学工作站数据处理系统，在质谱库(NIST08)中进行检索，并结合人工解析，鉴定挥发油中的化学成分。要求匹配度＞80%，以峰面积归一法测得挥发性物质各组分相对含量。飞龙掌血根皮油中主要含有:(1)19 种烯烃类化合物，分别是 1 ～14，16，19，21，26和29号，总含量达到40.67%;(2)10种醇类化合物，分别是 15，17，18，20，22，23，25，27，28 和 30号，总含量为22.21%;(3)2种香豆素类化合物，分别是35和36号，含量占16.11%;(4)5种酮类化合物，分别是 24，31，37，40和 41号，含量占13.91%;(5)2种酰胺类化合物，分别是38和39号，含量占3.93%;(6)3种酯类化合物分别是32～34号，含量占3.17%。从飞龙掌血根皮油中总共鉴定出了41种脂溶性天然化合物，其中含量最多的依次是cubebol类异构体(14.05%，22号)、pimpinellin(13.92%，35号)、β-copaene类异构体(10.28%，8 号)、5，8-dimethoxy-2，3，10，10a-tetrahydro-1H，4aH-phenanthrene-4，9-dione(10.23%，37号)，见表1。飞龙掌血根皮油中的化学成分结构见图2，飞龙掌血根皮油化合物基本上都属于双环脂环烃类，普遍存在分子式、结构式都一样的多个同分异构体，比如 cubebol、6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl等。

图1 飞龙掌血根皮油的GC-MS分析色谱Fig.1 GC-MSchromatogram of root bark oil of Toddalia asiatica

表1 GC-MS分析鉴定出的飞龙掌血根皮油的41种化学成分Tab.1 Chemical constituents in root bark oil of Toddalia asiatica identified by GC-MS

序号 保留时间(min) 分子式 分子量 化合物名称 CAS号 相对百分含量(%)9 10.330 C15 H24 204.351 1 an isomer of 1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydronaphthalene 30021－74－0 6.16 10 10.376 C15H24 204.351 1 (1S-cis)-1，2，3，5，6，8a-hexahydro-4，7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthalene 483－76－1 2.42 11 10.448 C15H24 204.351 1 an isomer of 1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydronaphthalene 30021 －74 －0 0.93 12 10.500 C15H24 204.351 1 an isomer of(1S-cis)-1，2，3，5，6，8a-hexahydro-4，7-dimethyl-1-(1-methylethyl)naphthalene 483－76－1 3.22 13 10.630 C15 H24 204.351 1 1-isopropyl-4，7-dimethyl-1，2，4a，5，6，8a-hexahydro-naphthalene 17627－24－6 0.27 14 10.696 C15 H20 200.319 3 α-calacorene 21391－99－1 0.25 15 10.748 C15 H26 O 222.366 3 cubebol 23445－02－5 2.03 16 10.852 C15 H24 204.351 1 ［1R-(1α，3aβ，4α，7β)］-1，2，3，3a，4，5，6，7-octahydro-1，4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene 22567 －17 －5 2.68 17 10.943 C15 H26O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 1.22 18 11.009 C15 H24O 220.350 4 isospathulenol 88395－46－4 0.45 19 11.074 C15 H24 204.351 1 an isomer of［1R-(1α，3aβ，4α，7β)］-1，2，3，3a，4，5，6，7-octahydro-1，4-dimethyl-7-(1-methylethenyl)-azulene 22567－17－5 1.04 20 11.120 C15 H26O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 0.37 21 11.256 C15 H24 204.351 1 β-guaiene 88－84－6 1.11 22 11.335 C15 H26 O 222.366 3 an isomer of cubebol 23445－02－5 14.05 23 11.380 C15 H24 O 220.350 4 an isomer of isospathulenol 88395－46－4 2.00 24 11.413 C14H22 O2 222.323 3 6-(3-acetyl-2-methyl-1-cyclopropen-1-yl)-6-methyl-2-heptanone 65868－86－2 0.37 25 11.478 C15 H26 O 222.366 3 t-muurolol 19912－62－0 0.48 26 11.602 C15 H24 204.351 1 1R，4S，7S，11R-2，2，4，8-Tetramethyltricyclo［5.3.1.0(4，11)］undec-8-ene 1000140－07－6 3.17 27 11.687 C15 H22O 218.334 6 (1R，4S)-4-Isopropyl-1，6-dimethyl-1，2，3，4-tetrahydronaphthalen-1-ol 123931－36－2 0.32 28 11.726 C15 H22O 218.334 6 an isomer of(1R，4S)-4-Isopropyl-1，6-dimethyl-1，2，3，4-tetrahydronaphthalen-1-ol 123931 －36 －2 0.46 29 11.863 C15 H24 204.351 1 an isomer ofβ-guaiene 88－84－6 1.68 30 11.902 C15 H26 O 222.366 3 an isomer of T-muurolol 19912－62－0 0.83 31 12.235 C15H26 O2 238.365 7 oplopanone 1911－78－0 1.74 32 13.363 C17H34 O2 270.450 6 hexadecanoic acid methyl ester 112－39－0 0.48 33 13.806 C18H36 O2 284.477 2 hexadecanoic acid ethyl ester 628－97－7 1.25 34 14.471 C19H34 O2 294.472 1 methyl 9-cis，11-trans-octadecadienoate 1000336 －44 －0 1.44 35 14.856 C13 H10 O5 246.215 5 pimpinellin 131－12－4 13.92 36 15.541 C13 H10 O5 246.215 5 isopimpinellin 482－27－9 2.19 37 15.750 C16 H18 O4 274.311 7 5，8-dimethoxy-2，3，10，10a-tetrahydro-1H，4aH-phenanthrene-4，9-dione 93240 －99 －4 10.23 38 16.285 C17 H26 N2 O 274.401 2 N-(1-ethyl-2，2，4-trimethyl-3，4-dihydroquinolin-7-yl)propanamide 63134－09－8 1.99 39 16.448 C17 H26 N2 O 274.401 2 an isomer of N-(1-ethyl-2，2，4-trimethyl-3，4-dihydroquinolin-7-yl)propanamide 63134－09－8 1.94 40 16.571 C16H16 O4 272.295 8 6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl 145068 －43 －5 0.47 41 16.813 C16 H16 O4 272.295 8 an isomer of 6'-formyl-2，3，4'-trimethoxy-1，1'-biphenyl 145068－43－5 1.10

图2 GC-MS鉴定出的飞龙掌血根皮油中化学成分的结构Fig.2 Structure of chemical constituents in root bark oil of Toddalia asiatica identified by GC-MS

3 讨论

飞龙掌血根皮是我国西南地区民间传统外伤治疗中药，其根皮一直作为药用部位用药安全、有效。本课题组围绕飞龙掌血根皮开展了系统的药效物质基础研究工作。鉴于飞龙掌血根皮含有较丰富的脂溶性油，常规分离策略并不适用于该油类成分的基础研究，最终选择GC-MS方法用于此次飞龙掌血根皮油的定性定量分析中。本研究发现飞龙掌血根皮含有大量C15H24系列化合物及其衍生物，大部分都属于双环脂环烃类，这些结果跟现有文献报道一致［11－13］，提示飞龙掌血中油类成分主要存在于该植物的根皮中，也部分分布于叶中，该药材来源植物的非根皮部位的药用价值值得后续进一步研究。

飞龙掌血根皮油的提取方法不同于一般天然药物挥发油的制备方法，因此在飞龙掌血根皮油GC-MS色谱图的0～8 min保留时间里，除了扣去空白溶剂色谱峰外(0～3 min)，没有其他色谱峰的存在。制备得到的飞龙掌血根皮油能够代表、并合理解释飞龙掌血根中油类成分，也是对现有飞龙掌血挥发油研究结果的最大补充、完善。

本研究从飞龙掌血根皮油中发现了pimpinellin及isopimpinellin，这与课题组前期在飞龙掌血根皮乙酸乙酯部位、飞龙掌血根皮正丁醇部位都分离得到上述两个化合物相吻合，提示pimpinellin及isopimpinellin在飞龙掌血根皮中含量比较突出，可以合理解释飞龙掌血根皮在临床上治疗风湿疼痛、跌打损伤、伤口出血等的物质基础［8，14］。本研究结果为飞龙掌血根皮油的鉴别和开发应用提供必要理论依据。