有限稀释法制备RecQ解旋酶单克隆抗体1C1及鉴定*＊

张荣红，贾铁文，何志旭，刘杰麟＊＊

(1.贵州医科大学组织工程与干细胞中心，贵州贵阳 550004;2.贵州医科大学免疫学教研室，贵州贵阳 550004)

RecQ解旋酶是DNA解旋酶SF2超家族中的一个家族［1］，在生物体内起着至关重要的作用，诸如DNA复制、转录、重组和修复等［2］。人类有5种RecQ 解旋酶 (RecQ1，WRN，BLM，RecQL4 和RecQ5)，其中BLM、WRN和RecQ4基因的突变分别会引起Bloom综合征、Werner综合征以及Rothmund-Thomson综合征，这些综合征加速老化症状和癌症发病率［2－8］。此外，RecQ1、BLM、RecQ4、RecQ5 等在多种肿瘤中均高表达［9－15］，与肿瘤细胞的转移、侵袭、耐药与代谢密切相关。这些研究结果均提示RecQ解旋酶与肿瘤关系密切，有望成为肿瘤诊断标志或肿瘤治疗的新靶点。由于大肠杆菌RecQ解旋酶的3个功能结构域与人RecQ解旋酶高度同源，其结构及功能与人类RecQ解旋酶极为类似，是研究人类 RecQ解旋酶的重要模型［16］，文献报道从大肠杆菌中获得了高纯度的RecQ解旋酶具有DNA结合活性［17－18］。单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)作为一种高效的生物制品在肿瘤的诊断和治疗方面显示出极大的应用价值，且单克隆抗体的制备技术是一项非常成熟的技术手段［19］。然而，目前抗RecQ解旋酶mAb方面的相关报道甚少，本研究使用纯化的重组大肠杆菌RecQ解旋酶免疫小鼠，利用杂交瘤技术及有限稀释法制备抗RecQ解旋酶的mAb，并考察其特异性及活性。

1 材料和方法

1.1 材料

8～10周龄雌性BALB/c小鼠，体质量18～22 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。纯化后的重组大肠杆菌RecQ解旋酶、SP2/0骨髓瘤细胞为贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心储存。胎牛血清、超级新生牛血清购自杭州四季青公司，甲基纤维素、Freund完全佐剂(Freund＇s complete adjuvant，FCA)、Freund 不完全佐剂(Freund＇s incomplete adjuvant，FIA)、PEG4000 购自 Sigma 公司，RPMI1640培养基(粉剂)购自Gibco公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司，mAb亚型鉴定试剂盒购自中国洛阳塞尔维公司，考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，秋水仙素溶液购自北京百奥莱博科技有限公司。X射线胶片购自柯达，超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所，96孔、24孔、6孔培养板购自Costar公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的鉴定 通过对重组大肠杆菌RecQ解旋酶的诱导表达［17］，获得纯度高、活性好的大肠杆菌重组RecQ解旋酶，具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性等。抗原大肠杆菌重组RecQ解旋酶按南京建成生物工程研究所“考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒”说明书操作，检测纯化后重组大肠杆菌RecQ解旋酶蛋白浓度，并用SDS-PAGE上样测定抗原重组大肠杆菌RecQ解旋酶蛋白的纯度。

1.2.2 小鼠免疫及抗体效价检测 以纯化鉴定后的重组大肠杆菌RecQ解旋酶免疫Balb/c小鼠，参考文献［20］操作。根据方阵滴定试验确定抗原包被浓度，间接ELISA测定小鼠血清抗体效价。

1.2.3 细胞融合 取免疫小鼠的脾细胞，并收集处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞，脾细胞与骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合，1 000 r/min离心5 min洗涤2次，弃上清，取50%PEG 1 mL，1 min内沿管壁缓缓滴入两种混合细胞中，同时轻轻摇晃，加完后用吸管轻轻搅拌数秒后静置2 min;用RPMI-1640不完全培养基多次分批终止反应，800 r/min离心5 min，弃上清，得细胞沉淀。

1.2.4 有限稀释法筛选杂交瘤细胞 参照文献［21］进行实验。(1)融合细胞沉淀中加入HAT培养基重悬;将细胞悬液以100μL/孔铺于96孔培养板中，同时铺适当复孔的SP2/0细胞作为HAT选择培养的阴性对照。(2)融合3 d后，镜下观察细胞克隆生长情况并标记，以后2周每隔2 d用HAT选择培养基半量换液，并收集上清间接ELISA法进行检测。在第2周后和4周分别换成HT选择性培养基培养和完全培养基培养，选取最强阳性克隆进行亚克隆。(3)在有限稀释前一天收集未经免疫Balb/c小鼠的腹腔细胞作为饲养细胞，HAT选择性培养基重悬后按100μL/孔铺到96孔培养板中培养过夜。(4)亚克隆:用HT选择培养基将阳性杂交瘤细胞稀释成100个/mL、50个/mL、10个/m3个浓度，按100μL/孔分别加入到含饲养细胞的96孔细胞培养板中继续培养7～10 d。(5)第4天起开始在显微镜下观察细胞克隆情况，对单细胞克隆孔进行标记;7 d后用RPMI-1640完全培养基进行半量换液，同时收集上清做间接ELISA检测。(6)重复多次有限稀释，直到所有仅一个细胞集落生长的培养液上清ELISA检测结果均为阳性为止。

1.2.5 腹水制备mAb (1)小鼠的预处理:选取10周龄的健康、雌性Balb/c经产鼠数只，在接种杂交瘤细胞前2周，每只小鼠腹腔注射医用液体石蜡0.5 mL;预处理过的小鼠在2～3个月内均可使用。(2)收集对数生长期生长状态良好的杂交瘤细胞1C1，离心，弃上清，用不完全培养基悬浮细胞并调整细胞密度为4×105个/mL，0.5 mL/只腹腔注射。(3)约1～2周后，见小鼠腹部明显膨大，用12号无菌针头从腹股沟上缘插入腹腔中，轻轻挤压小鼠腹部，放出腹水，收集于无菌离心管3 000 r/min离心15 min，去除上层油脂，分装保存于－80℃。隔天穿刺一次直至小鼠死亡。

1.2.6 mAb鉴定及生物学特性的分析 杂交瘤细胞染色体数分析:取杂交瘤细胞，加入秋水仙素液，37℃培养6 h后收获细胞，低渗处理、固定、制片、染色、镜检、照相，对染色体计数。mAb类型及亚型的鉴定:按照洛阳塞尔维公司单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明进行操作。mAb效价的测定:间接ELISA测定腹水、杂交瘤细胞上清抗体滴度，以Sp2/0培养液为阴性对照。杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性研究:将杂交瘤细胞连续传代培养3个月，定期用间接ELISA测其培养液中的抗体活性，观察杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

1.2.7 mAb特异性鉴定 参照文献［22］方法鉴定mAb的特异性。纯化的RecQ解旋酶经SDSPAGE，转膜后用BALB/c小鼠腹水mAb做一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶5 000)做二抗，DAB显色。

1.2.8 mAb功能活性的测定 将mAb进行系列梯度稀释13个浓度后与定量(10μL)的纯化RecQ蛋白混匀，置37℃水浴中孵育2 h。采用荧光偏振检测技术［23］分析不同浓度的mAb阻断RecQ解旋酶与DNA结合的能力。

1.3 统计学分析

SPSS 20.0软件统计分析数据，计量资料用均数±标准差(±s)表示，两组间比较用t检验，计数资料以百分率表示，采用χ2检验;P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RecQ解旋酶蛋白的纯度

将纯化后的重组RecQ蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果表明，重组RecQ蛋白经镍柱层析纯化后无杂带，纯度高，其分子量约为69 kD，与预期分子量相符，浓度为1.834 g/L，可作为抗原免疫小鼠。

2.2 抗原包被最佳浓度的确定

用方阵法筛选抗原最佳包被浓度，结果见表1，根据表中结果可知，抗原包被浓度为0.2 mg/L，血清稀释度为1/1 000时，OD490测定结果接近0.9，可获得较好的检测结果。因此，抗原包被的最佳工作浓度为0.2 mg/L。

表1 不同抗原包被浓度下的OD490值Tab.1 OD values at 490 nm under different concentrations of antigen

2.3 有限稀释法获得抗RecQ解旋酶杂交瘤细胞株1C1

在细胞融合后第3天即可见杂交瘤细胞成集落性生长，11 d后可见部分培养孔的杂交瘤细胞生长至孔底的近1/3。杂交瘤细胞镜下呈圆形，比SP2/0骨髓瘤略大，细胞透明度大，折光性强，见图1。第3天半量换液时即用间接ELISA法对培养上清液进行检测，此后每次半量换液均进行复测，将反复多次检测为阳性结果的细胞用有限稀释法进行亚克隆。本方法结果得到1株阳性克隆，编号为“1C1”，经扩增培养并反复检测，该细胞株在体外连续传代培养3月以上仍可稳定分泌抗RecQ单克隆抗体，见表2。

图1 杂交瘤细胞形态(有限稀释法)Fig.1 The morpha of a hybridoma colony(limited dilution)

表2 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性Tab.2 The stability of the hybridoma-secreting mAb

2.4 抗RecQ解旋酶mAb生物学特性及鉴定

所获得1C1阳性杂交瘤细胞株的染色体数目为94～104条(图2A)，是两种亲本细胞的染色体数目之和。染色体核型主要为端着丝粒，少数为中着丝粒(图2B)。通过洛阳塞尔维公司生产的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得mAb的亚类为IgG1(见表3)。间接ELISA法检测1C1培养上清的抗体效价为1×10－3，诱生的腹水抗体效价为1×10－5。Western blot可观察到69 000 kD处有清晰特异性条带图2C，表明抗RecQ解旋酶mAb能与RecQ解旋酶产生特异性反应。

图2 抗RecQ解旋酶mAb的鉴定Fig.2 Identification of RecQ helicase mAb

表3 间接ELISA法鉴定单克隆抗体亚类Tab.3 mAb subtype determined by indirect ELISA assay

2.5 单克隆抗体对RecQ解旋酶活性抑制的结果

本研究结果显示，当抗RecQ解旋酶mAb的稀释度在1∶800时，RecQ蛋白结合DNA的活性明显降低，并随抗体稀释浓度的增加，RecQ蛋白的DNA结合活性逐渐恢复(图3)。表明制备的抗RecQ解旋酶mAb具有抑制RecQ蛋白结合DNA的活性，且在1∶800稀释度时活性最佳。

图3 不同浓度mAb对RecQ蛋白结合DNA活性的影响Fig.3 The effect of different concentration of mAb on DNA binding activity of RecQ

3 讨论

单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具，其在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可或缺的作用，在人类和动植物的免疫学诊断方面至今仍有着无可代替的重要作用。Khler和Milstein于1975年利用杂交瘤技术成功建立了单克隆抗体制备技术［22］，据估计在近四年内mAb的全球市值超1 250亿美元［23］，具有广阔市场和应用前景［23－24］。

RecQ解旋酶在维持DNA正常代谢及维护染色体稳定性方面发挥着重要作用，虽然RecQ解旋酶的作用机制目前仍不十分明确，但研究表明RecQ解旋酶的突变、缺失或功能失常与肿瘤的发生密切相关［9－15］，并有望成为新的肿瘤标志物或成为肿瘤治疗的新靶点。骆衡等［17］通过诱导大肠杆菌体外表达，获得了高纯度的RecQ解旋酶，具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性以及DNA依赖的ATP酶活性，相比双链DNA，该RecQ解旋酶更易与单链DNA结合。黄振蓉等［18］通过PCR也从大肠杆菌中获得纯度大于90%的RecQ解旋酶，具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。目前只有1例成功获得抗RecQ解旋酶mAb的报道［18］，本课题组通过甲基纤维素半固体筛选得到能稳定分泌抗RecQ解旋酶mAb的杂交瘤细胞株6H5。文献报道表明，有限稀释法与甲基纤维素半固体法是杂交瘤细胞筛选及克隆化培养的两种常用方法［25－26］。为了探究不同方法对抗RecQ解旋酶mAb的分泌是否有影响，本实验选择纯化后重组大肠杆菌RecQ解旋酶作为抗原，在阳性免疫应答后，分离脾细胞并与骨髓瘤细胞融合，以产生稳定、长寿的抗体产生细胞系—杂交瘤细胞，并采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行筛选及克隆化培养，获得了能稳定分泌抗RecQ解旋酶mAb的细胞株1C1，染色体数目为94～104。该杂交瘤细胞具有持久分泌抗体的能力，其分泌的抗体类型为IgG1型，培养上清的抗体效价为1×10－3，诱生的腹水抗体效价为1×10－5，该mAb能特异性地与RecQ解旋酶结合，且在1/800时可显著抑制RecQ解旋酶与DNA的结合，与半固体法得到的6H5抗体相比，效价稍低，但活性相当，都具有相同的生物活性。

综上所述，有限稀释法作为传统筛选方法，技术成熟，操作简单，成本较低，应用广泛，作为科学研究，目前大多数单克隆抗体的制备仍采用有限稀释法筛选制备。该抗RecQ解旋酶mAb的成功获得为进一步研究肿瘤的发生发展、肿瘤的诊断及治疗提供了有力的工具。