FcγRIIB缺失加重顺铂诱导小鼠的急性肾损伤*＊

金筱茜，吴通前，马 岚，钟 沁，周 玲，高 健，袁 锐，余 芳，＊＊＊

(1.贵州医科大学临床微生物及免疫学教研室，贵州贵阳 550004;2.贵州医科大学附院临床研究中心，贵州 贵阳 550004;3.贵州医科大学附院临床检验中心，贵州贵阳 550004)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的死亡率较高，会增加慢性肾病风险和住院时间［1］，全球每5名住院患者中就有1人受到AKI影响［2］。在住院患者中，成人AKI相关死亡率为24%，儿童为14%［3］;在重症监护病房，AKI的发生率为50% ～70%，死亡率大于50%［2］。有研究表明，炎症机制参与顺铂引起 AKI［4］。免疫反应中可与 IgA、IgE、IgD、IgM和IgG免疫球蛋白结合的受体统称为FcRs，属于免疫球蛋白家族的一份子，是细胞膜表面的糖蛋白，可结合抗体，连接固有及适应性免疫反应中细胞(中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞和B细胞等)效应区域，帮助细胞识别病原及微生物［5］，并诱导相应效应。FcγR 即 IgG Fc段受体，人和灵长类动物只有 FcγRI、FcγRII、FcγRIII 三个亚群，而小鼠有 FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRRIII(CD16)、FcγRIV 四个亚群［6］，因其结构不同而具有不同功能。表达FcγRIIB细胞的胞浆区的受体为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)，在发生磷酸化后可抑制B淋巴细胞活化及增殖等传递抑制性信号［7－8］，参与一系列炎性疾病(自身免疫反应和感染性疾病)过程［9］。在肾小球肾炎模型中，老年鼠FcγRIIB受体表达较低，症状较中年鼠轻［10］。炎性组织中炎性细胞表面的FcγRIIB表达增高，这有助于在免疫效应阶段增高免疫反应细胞活性阈值以应对炎性反应［11］。而另一些研究表明，缺乏FcγRIIB小鼠在分支杆菌感染时会分泌更多的IL-12提高感染抗性［12］。FcγRIIB作为唯一抑制性受体，虽然已知其与炎症反应有关，但是它在AKI中的作用还不明确，因此本研究通过顺铂诱导FcγRIIB野生型小鼠及FcγRIIB基因敲除小鼠AKI，探究FcγRIIB在AKI中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型(FcγRIIB+/+)C57BL/6小鼠购自北京华富康生物科技有限公司，FcγRIIB基因敲除(FcγRIIB－/－)C57BL/6小鼠由哥德堡大学MIVAC医学实验动物中心赠予。所有实验均使用8～10周雄性小鼠，并于特定无病原体的实验室饲养，动物实验方案经贵州医科大学动物保护委员会批准并实施(证号1503057)。

目前国内有关运费险的研究在针对消费者购买运费险的具体决策过程和心理刻画方面相对不足，因此可将消费者在面对商家是否提供运费险时的决策过程作为继续研究运费险问题的新切入点。

1.1.2 主要试剂及仪器 顺铂(美国Sigma公司)，血清肌酐(Scr)试剂盒(南京建成生物有限公司)，血清尿素氮(BUN)试剂盒(南京建成生物有限公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美)，多聚甲醛(美国Sigma公司)。组织脱水机(德国莱卡)，石蜡包埋机(德国徕卡)，手动切片机(德国徕卡)，冷冻离心机(美国赛默飞世尔公司)，光学显微镜(德国徕卡)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药 随机将FcγRIIB+/+小鼠和 FcγRIIB-/－小鼠分为 FcγRIIB+/+对照组，FcγRIIB+/+AKI 模 型 组，FcγRIIB－/－对 照 组，FcγRIIB－/－AKI模型组，每组5 只小鼠。模型组按照20 mg/kg体质量腹腔注射顺铂，对照组腹腔注射等量生理盐水。

HE染色可见，FcγRIIB+/+AKI模型组及FcγRIIB－/－AKI模型组小鼠肾小管上皮肿胀、刷状缘脱落，炎性细胞浸润，肾小球形态大致正常;FcγRIIB－/－AKI模型组小鼠较 FcγRIIB+/+AKI模型组小鼠肾小管坏死症状更严重。FcγRIIB+/+对照组及FcγRIIB－/－对照组小鼠肾脏组织结构形态大致正常。与 FcγRIIB+/+对照组及 FcγRIIB－/－对照组相比，AKI组ATN评分明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01);FcγRIIB－/－AKI模型组小鼠较FcγRIIB+/+AKI模型组小鼠ATN分值更高，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图2。

1.3 统计学方法

尤为重要的是，改编经典科普巨著的难度较大，而这些作者们在写作中进行了创新性解读，得到了同行专家学者的赏激。儿童文学作家、首都师范大学教授金波老师认为这是中国当代第一套专门写给少年儿童的经典文库作品；中科院院士许智宏，地理学家、中国科学院院士陆大道，中国科学院院士周忠和，著名科普作家叶永烈，中国工程院院士、中国医学科学院药用植物研究所名誉所长肖培根等学者都对这套文库赞赏不已，并作序推荐给少年儿童。

2 结果

2.1 一般情况

与 FcγRIIB+/+对照组及 FcγRIIB－/－对照组比较，FcγRIIB+/+AKI模型组及 FcγRIIB－/－AKI模型组肾脏组织匀浆TNF-α及IL-6含量均升高(P＜0.05)，FcγRIIB－/－AKI模型组增加更为明显，差异有统计学意义(P＜0.01);而IL-10含量降低，在FcγRIIB－/－AKI模型组降低更为明显，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图1。

对教师进行了问卷调查，并进行整理、分析，得出结论。教师团队目前学历分布情况是：研究生约占3%、本科约占70%、专科约占26.7%。教师队伍有扎实的知识积累，乐于学习、乐于思考、有干劲和热情，但对教育理论向教学实践方面的转化还有些滞后，部分教师的教学方法和策略还有待提高。

2.2 血清Scr和BUN

气瓶充装站原料储罐介质具有令人窒息、易燃、易爆、腐蚀等危险性质，一旦发生安全事故，人员无法有效靠近。GB/T 18442.6—2011《固定式真空绝热深冷压力容器第6部分：安全防护》和GB 50160—2008《石油化工企业设计防火规范》对远程紧急切断系统具有严格的要求。

使用GraphPad Prism6软件分析数据，计量数据以均数±标准差(±s)表示，两个独立样本组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 各组小鼠血清Scr及BUN水平(x±s，mg/L)Tab.1 Serun levels of Scr，BUN in each group

2.3 肾脏组织匀浆TNF-α、IL-6及IL-10表达水平

实验期间，模型组小鼠活动减少，精神萎靡，进食减少，体毛光泽欠佳，对照组小鼠活动良好，精神以及进食正常。

与 FcγRIIB+/+对照组及 FcγRIIB－/－对照组比较，FcγRIIB+/+AKI模型组及 FcγRIIB－/－AKI模型组小鼠Scr和BUN明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01);与 FcγRIIB+/+AKI模型组比较，FcγRIIB－/－AKI模型组小鼠Scr和BUN 显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

图1 各组小鼠肾脏组织匀浆TNF-α，IL-6和IL-10表达水平Fig.1 Levels of TNF-α，IL-6 and IL-10 in kidney homogenate

2.4 肾脏组织学改变

1.2.2 观测指标 注射72 h后，收集各组小鼠腋动脉血，分离血清检测血清Scr和BUN;之后吸入麻醉处死小鼠，取双侧肾脏;左肾后按照试剂盒说明，冰上电动研磨成组织匀浆，ELISA法检测TNF-α、IL-6及IL-10表达水平。分离小鼠右肾，用4%多聚甲醛水溶液固定，石蜡包埋，切片3μm厚，苏木素－伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肾组织;肾损伤以肾小管上皮肿胀、刷状缘脱落、空泡变性为基础，采用半定量评分法，每张切片(200×)取相同组织结构部位随机10个视野，0分表示损伤面积＜10%，1、2、3和4分则分别表示损伤面积为10% ～＜25%、25～ ＜50%、50～ ＜75%、≥ 75%;评分后计算其平均值，评估肾小管坏死(ATN)程度［13］。

3 讨论

肾功能可通过血肌酐、血尿素氮水平及组织病理学反映。本实验模型组小鼠血清Scr及BUN明显升高，病理组织明显改变，说明AKI模型成功。实验结果显示 FcγRIIB－/－模型组小鼠血清 BUN及Scr，肾脏病理损伤以及组织炎性因子高于野生型小鼠，说明FcγRIIB在顺铂诱导的AKI中可能抑制病情的发展。

顺铂肾毒性的特点是可激活促炎细胞因子。细胞因子TNF-α在顺铂诱导肾损伤中发挥重要作用，抑制TNF-α释放或活性可减轻顺铂肾毒性，这与TNF-α可能导致肾上皮细胞损伤有关［14］。顺铂诱导AKI随肾脏IL-6产生增多而加重［15］。顺铂诱导的肾损伤包括肾小管细胞DNA碎裂，肿瘤抑制蛋白P53、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白介素6(IL-6)水平升高［16］。因此肾脏炎症以及炎性因子的表达在AKI中起至关重要的角色。

图2 各组小鼠肾脏组织学(HE，×200)Fig.2 Kidney injury condition of mice in each group

FcγRIIB是人类和小鼠体内唯一的抑制性受体，通过胞质区域中含有的基于酪氨酸免疫抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)传递抑制信号［17－18］。研究表明，在真菌感染 FcγRIIB－/－小鼠体内血清炎性因子 TNF-α 和IL-6水平高于野生型小鼠，以对抗 FcγRIIB－/－小鼠体内更高的载菌量［19］。这与本研究中，顺铂诱导的肾损伤，组织匀浆促炎子性因子TNF-α和IL-6升高相一致，而抗炎性细胞因子IL-10呈现下降趋势，而且在FcγRIIB－/－小鼠中下降趋势更明显。白细胞介素-10(IL-10)是一种具有抗炎特性的细胞因子，通过限制病原体的免疫反应从而防止对宿主的损害，在炎性及感染过程中发挥核心作用［20］。橘皮素可通过下调TNF-α以及上调IL-10减轻顺铂毒性［21］。在真菌感染小鼠体内，血清IL-10水平下降［19］。FcγRIIB 通过 ITIM 传导抑制信号时，可形成SH2识别结构域，继而招募包含SH2的肌醇磷酸酶(SHIP)等分子，在通过PI3K将3，4，5磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)水解为4，5磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)［22］，此脱磷酸过程可抑制PIP3聚集含有PH(pleckstrin homology)结构域蛋白，比如磷脂酶Cγ(PLCγ)，可使其聚集到细胞膜，引起膜离子膜离子通道改变，减少钙离子内流，从而抑制相关激酶参与的细胞活化效应，加强吞噬作用、减少细胞因子或抗体的产生等［8］。因此 FcγRIIB－/－小鼠对炎症诱导表现出更高反应性，组织病理损伤更严重，高水平促炎因子和低水平抑炎因子加重AKI的进程。

综上所述，本实验通过顺铂诱导建立AKI模型，观察到FcγRIIB可能对AKI病程起保护作用，这为临床治疗AKI提供了新的靶点，但是FcγRIIB参与AKI过程涉及的细胞或者效应蛋白分子，以及在人类中是否同样具有抑制顺铂诱导AKI病程的作用，仍需要进一步研究。