壳聚糖DNA电化学生物传感器的伏安法研究以及对NPT II基因的检测

任勇

(淄博师范高等专科学校数理科学系，山东淄博 255130)

0 引言

自1983年，世界上首次报道转基因产品以来，转基因农作物在世界范围内得到了广泛的推广，对解决一些贫困和落后地区的粮食危机、营养不良等系列问题发挥了重要作用.但随着其日益深入人们的生活，特别是全球范围内出现的多起由转基因植物产品引起的环境、食品、人类遗传等问题，在世界范围内引起了广泛关注，迫切需要可靠地技术对其进行分析和检测.DNA电化学生物传感器是一种生命科学、材料科学、信息技术等多种学科相互交叉渗透的高新技术，具备分析速度快、灵敏度高、操作简便等特点，在DNA特定序列检测、基因筛选、食品安全等方面有广阔的应用前景[1-5]，目前已经成为转基因产品检测分析的一项核心技术.

在众多关于DNA电化学生物传感器的研究中，如何使ssDNA探针有序、稳定的固定在电极表面始终是研究的热点问题，因为其固定数量和牢固程度将直接影响传感器的稳定性、灵敏度和使用寿命.目前，DNA探针的固定方法有表面吸附法[6]，共价键合法[7-9]，LB膜技术[10]，生物素-亲和素法[11]，电聚合法[12]等.近年来，关于在壳聚糖膜上固定DNA已有研究.壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，具有极好的成膜能力和分散性，被广泛应用于电极修饰测定多种物质[13-14]，尤其是其氨基可以和DNA的磷酸基团形成一种紧密络合物，固定的DNA探针较为牢固.例如，徐春等[15]曾在铂电极上通过壳聚糖固定DNA探针，所制得的电化学传感器对cDNA序列具有较高的选择性；苏会岚等[16]把壳聚糖膜纳米复合物修饰于玻碳电极表面制得的电化学传感器用以检测mir-21时效果良好；Kara等[17]以亚甲基蓝(MB)为指示剂，测定了DNA探针在壳聚糖修饰电极上杂交前后电化学信号的变化，并通过实验证明了壳聚糖与DNA的磷酸骨架有较强的结合能力.Wang等[18]将ssDNA探针固定在修饰有壳聚糖多壁碳纳米管的玻碳电极表面，制备的纳米组合膜电极检测效果良好.本实验将十八碳酸作为修饰剂改良了碳糊电极表面性质，通过电极表面富含的羧基与壳聚糖之间的静电作用自组装一层壳聚糖膜，利用壳聚糖与DNA的络合作用固定DNA探针，用循环伏安法对DNA的固定和杂交条件进行了优化分析，测定了不同修饰电极的表观电容，并对转基因油菜的外源NPT II基因片段进行了检测.

1 实验

1.1 主要仪器与试剂：

CHI 832电化学分析仪(上海辰华仪器公司)，三电极系统：DNA修饰碳糊电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝为对电极；电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂)；pHS-25型pH计(上海雷磁仪器厂).

壳聚糖购于上海未来实业有限公司，NPT II基因序列20碱基寡聚核苷酸片段购自北京SBS基因技术有限公司，各基因片段的碱基序列如下：

20碱基DNA探针 (ssDNA): 5'- GCA TCG AGC GAG CAC GTA CT -3'

目标基因，即转基因油菜外源NPT II基因的20碱基单链DNA片段，为DNA探针互补DNA(cDNA): 5'- AGT ACG TGC TCG CTC GAT GC -3'

2-碱基错配DNA (2-base mismatch DNA): 5'- AGT ATG TGC TCG CTC GTT GC -3',其中，2-碱基错配DNA序列的错配碱基已用下划线标出.

非互补DNA (ncDNA): 5'- CTT CTA CAT CTG GAG TGC TA -3'

其他化学试剂均为分析纯.

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖膜修饰电极制备

将壳聚糖溶解在1%的冰醋酸溶液中，25摄氏度超声至壳聚糖全部溶解均匀，备用.在抛光后的电极表面滴5 μL 0.5%的壳聚糖溶液，自然风干.然后将制得的电极置于pH 7.0 TE溶液中浸泡30 min，去除壳聚糖膜中的醋酸，即得壳聚糖膜修饰电极，记为chi/CPE.

1.2.2 DNA修饰电极的制备与杂交

将chi/CPE电极置于1.0×10-5mol/L的ssDNA溶液中，25摄氏度下自然富集20 min，然后分别在pH 7.0 TE缓冲溶液、蒸馏水内清洗5 min，自然晾干，制得探针修饰电极，记为ssDNA/chi/CPE.

在+0.4 V电位下，把上述制备的ssDNA/chi/CPE与靶DNA(cDNA)杂交5 min，然后分别在pH 7.0 TE缓冲溶液、蒸馏水内清洗5 min，自然晾干，制得双链DNA修饰电极，记为dsDNA/chi/CPE.为说明壳聚糖在固定ssDNA探针过程中的作用，本实验把ssDNA在未组装壳聚糖膜的碳糊电极上的固定、杂交作为对比实验.

2 讨论

2.1 MB在各修饰电极上的循环伏安行为

图1为用循环伏安法测得的1.5 × 10-5mol/L MB在不同修饰电极上的氧化还原峰电流讯号.

图1 MB在不同修饰碳糊电极上的循环伏安曲线，扫描速率：100 mV/s

曲线1为MB在CPE电极上的峰电流讯号，还原峰电位Epc在-0.227V，氧化峰电位Epa在-0.185 V，峰电位差(ΔEp)为0.042V，表现出良好的可逆性.曲线2为MB在chi/CPE上的峰电流讯号，还原峰电位Epc在-0.218V，氧化峰电位Epa在-0.156 V，ΔEp为0.062V，较比CPE有较大增加，说明其可逆性变差.同时，其还原峰电流ipc和氧化峰电流ipa分别较曲线1均有较大的降低，说明壳聚糖成功修饰到了CPE电极表面导致其表面性质发生了变化.这是因为，本实验在制备碳糊电极时，把十八碳酸作为电极修饰剂，从而使制得的电极表面富含羧基.由于羧基带负电荷，指示剂MB阳离子带正电荷，二者之间的静电作用使较多的MB在碳糊电极表面发生反应，从而表现出较大反应电流和较好的可逆性.而当在碳糊电极表面组装壳聚糖膜后，由于壳聚糖是一种天然的阳离子聚合物，与MB阳离子之间存在静电排斥作用，导致MB阳离子不易在电极表面富集，故电化学反应可逆性变差，氧化还原电流变小.

曲线3为MB在ssDNA/chi/CPE上的氧化还原峰电流讯号，比MB在chi/CPE的电流信号增大很多，证明ssDNA探针在chi/CPE上固定效果较好.这是因为壳聚糖的氨基可以和DNA的磷酸基形成一种紧密的络合物，壳聚糖膜以此方式使ssDNA探针固定在chi/CPE电极表面.由于ssDNA探针的自由碱基G与MB有很强的亲和力，在固定到chi/CPE电极表面后其自由碱基G暴露在外，极易与MB发生亲和作用，所以MB在ssDNA/chi/CPE上的电化学信号最为显著[19-21].观察其峰电位，Epc在-0.223V，Epa在-0.178 V，峰电位差(ΔEp)为0.045V，可逆性与曲线1接近.

曲线4为MB在ssDNA/chi/CPE电极与cDNA杂交后所得dsDNA/chi/CPE电极上的氧化还原峰电流讯号.曲线4的峰电流较曲线3有显著降低，但仍大于曲线2的峰电流，说明ssDNA/chi/CPE电极表面的ssDNA与cDNA发生杂交得到了dsDNA.峰电流减小的原因在于MB与单、双链DNA结合方式不同.杂交后，G碱基被包埋在dsDNA双螺旋结构内部，而不是像在ssDNA中的G碱基暴露于外，MB与dsDNA的嵌插作用小于MB与ssDNA的G碱基的特异性亲和力，故曲线4的氧化还原峰电流较曲线3有明显降低.但由于MB与dsDNA的嵌插作用，故MB在dsDNA/chi/CPE电极上的峰电流仍然大于在chi/CPE电极上的峰电流.

对比实验采用在不修饰壳聚糖膜的CPE电极上进行ssDNA的固定和杂交，并在相同条件下测量MB在CPE、ssDNA/ CPE、dsDNA/ CPE上的电化学信号.结果发现，MB在ssDNA/ CPE、dsDNA/ CPE上的氧化还原峰电流与在CPE上相比基本没有变化，说明，ssDNA探针不能在十八碳酸碳糊电极上直接固定.

2.2 修饰电极表观电容的测定

电极的表观电容是说明电极表面性质的一个重要参数.在1.0 mol/L KNO3溶液中进行循环伏安扫描，扫描范围为+0.40 V 至+0.60 V (vs.SCE)，记录在不同扫描速度(v，v<100 mV/s)下+0.5 V处的电容电流密度(jc).将jc对扫描速度作图，所得直线斜率即为电极的表观电容[22].各电极的表观电容见表1.

表1 实验测得的不同修饰电极的表观电容

由表中数据发现，chi/CPE电极的表观电容小于CPE的表观电容.这是因为：

C-1= d /εε'

式中，C为电极表观电容，d为电极表面电介质的厚度，ε为电介质的介电常数(电容率)，ε'为自由空间的介电常数.由公式可知，表观电容反比于电极表面电介质的厚度；同时，表观电容会因为在电极表面形成电双层而变大.当在电极表面组装壳聚糖膜后，电极表面电介质厚度(d)的增大导致了电极表观电容的降低；而在此壳聚糖膜上继续固定DNA探针后，由于在ssDNA/chi/CPE电极表面形成了电双层，因而DNA探针修饰电极的表观电容变大，甚至大于CPE电极表面的表观电容.这也从另一个方面证明，ssDNA探针可以很好的固定在壳聚糖膜电极表面.

2.3 DNA固定条件的优化

2.3.1 CPE组成的选择

碳糊电极因其制作简单、成本低廉、容易改良等优点而被广泛用于生物传感器研究.为了增强壳聚糖在电极表面的稳定性，本文把十八碳酸作为修饰剂和粘合剂制备碳糊电极.实验表明，当石墨粉、石蜡和十八碳酸的比例为9:2:1时，壳聚糖在电极表面的自组装膜性能稳定，不易脱落，固定的ssDNA 探针比较牢固，并且经抛光重复利用时性能稳定，测量数据偏差小.

2.3.2 壳聚糖浓度的优化

在本研究中，壳聚糖在碳糊电极表面的自组装成膜以及对ssDNA 探针的固定是核心内容，而壳聚糖浓度是影响其自组装成膜的重要因素.研究发现，在0.1%至0.5 %浓度范围内，壳聚糖浓度越大，MB在chi/CPE上的电化学信号持续变小，但超过0.5 %浓度后，减小的非常缓慢.说明当壳聚糖浓度在0.5 %时，其在碳糊电极表面的成膜效果最好.同样，在0.1%至0.5 %浓度范围内，壳聚糖浓度越大，MB在ssDNA/chi/CPE上的电化学信号持续变大，但超过0.5 %浓度后，增加的非常缓慢.说明，当chi浓度为0.5%时，chi/CPE对ssDNA 探针的固定效果最佳[23](P50).综合上述壳聚糖浓度对在电极表面自组装成膜和对ssDNA 探针的固定两方面的考虑，本研究所用壳聚糖浓度选择0.5 %.

2.3.3 杂交时间的选择

ssDNA/chi/CPE与cDNA的杂交时间是影响检测结果的重要因素.本实验测定了ssDNA/chi/CPE与cDNA不同杂交时间的电化学信号，并以MB为指示剂对结果进行表征，如图2所示.

图2 杂交时间对杂交效果的影响

实验表明，在0到5min范围内，随着反应时间的增加，峰电流逐渐降低，说明杂交逐步进行.当杂交时间超过5min时，峰电流有增大趋势，说明杂交完成后，MB与DNA磷酸骨架的吸附作用逐渐增强，会影响检测效果.故选择5min为本实验的杂交时间.

2.4 探针修饰电极的稳定性的研究

按照本研究所述方法同时制备30支ssDNA/chi/CPE修饰电极，按照10支一组分成三组，分别置于2 mL pH 6.0的B-R缓冲溶液、2 mL pH7.0磷酸盐缓冲溶液、2 mL 2×SSC缓冲溶液中，30℃下静置3 h后，将各组电极分别转移至1.5×10-5mol/L MB溶液中，分别用循环伏安法测量MB在各支探针修饰电极上的氧化还原峰电流，结果发现经过浸泡后，各支电极的氧化还原峰电流均未减小；再以紫外光谱法对三组浸泡ssDNA/chi/CPE电极的溶液进行定性分析(因为一支电极上固定的ssDNA量较少，所以用平行制得的多支电极同时浸泡)，在260 nm处没有观察到DNA的紫外吸收峰，说明溶液中没有DNA[23](P67).上述两项实验均证明，经过长时间浸泡后，没有ssDNA探针从ssDNA/chi/CPE修饰电极上脱落，说明通过壳聚糖膜固定的ssDNA探针非常稳定，能对互补的ssDNA序列进行检测.

2.5 转基因油菜外源基因片段的检测

图3为用本实验制得的传感器在pH 6.0 B-R缓冲溶液中，以1.5×10-5mol/L MB为指示剂，用微分脉冲伏安法测定转基因油菜外源基因片段结果.

图3 微分脉冲伏安法检测合成转基因油菜外源NPT II基因片段

曲线1为MB在chi/CPE上的微分脉冲伏安曲线.由于壳聚糖与MB阳离子之间的静电排斥作用，故峰高最小.相比曲线1，MB在固定转基因油菜外源NPT II基因片段的ssDNA/chi/CPE上得到最大的峰高如曲线2，其峰电位在-0.186 V，说明NPT II基因片段的ssDNA探针成功固定在chi/CPE电极表面.按照本研究所述方法，将固定有NPT II基因片段的ssDNA探针修饰电极与其cDNA杂交后，再以微分脉冲伏安法对其进行检测得到曲线3，其峰高显著降低，且三次实验结果一致.说明，该传感器能实现对NPT II基因片段互补序列的有效检测.

在同样杂交条件下，分别用非互补的20碱基的ssDNA、2-碱基错配ssDNA代替NPT II基因互补序列作为对比实验，用微分脉冲伏安法检测分别得到曲线4、曲线5 .比较曲线4和曲线2的峰高可知，固定有NPT II基因片段的ssDNA探针修饰电极与非互补的ssDNA基本没有发生杂交；比较曲线5和曲线2的峰高可知，固定有NPT II基因片段的ssDNA探针修饰电极与2-碱基错配ssDNA发生了部分杂交.实验说明，此传感器既可识别NPT II基因片段，同时对其碱基错配序列和非互补ssDNA序列也具有较好的识别能力[23](P57).

3 结论

研究发现，本实验制得的十八碳酸碳糊电极与壳聚糖膜结合紧密，通过壳聚糖膜固定的 DNA探针牢固，对其互补DNA序列有较好的检测识别功能，说明壳聚糖是一种理想的电极表面修饰物质.相比前期关于生物传感器的系列研究，通过壳聚糖膜制备的传感器比通过金属离子膜制备的传感器电化学信号较强，MB在不同阶段的修饰电极上电化学信号变化明显，说明chi/CPE较Al3+/CPE修饰电极在DNA探针的固定和检测方面具备优势，为生物传感器的深入研究拓宽了材料选择范围.研究发现，实验用到的溶液PH值、指示剂的选择及浓度、扫描速率等对实验结果都有一定的影响.下一步要优化各种实验条件，在传感器的稳定性、重现性方面进行深入研究.