7 株野生葡萄酒酵母对‘桂葡3号’干白葡萄酒香气成分的影响

余 欢，管敬喜，杨 莹*，黄晓云，成 果，谢太理，谢林君

（广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西 南宁 530007）

‘桂葡3号’是欧美杂交种葡萄“金香（Vitis vinifera×Vitis labrusca）”中选育出的芽变新品种。成熟时果皮金黄，可溶性固形物含量高，果香浓郁，适合酿造南方特色优质干白葡萄酒[1]。其平均单果粒质量5.5 g，且果实肉囊较多[2]，出汁率较低（50%～55%）[3]。

葡萄酒的芳香物质在葡萄酒风格与质量评价中起着重要作用，其中葡萄果实、酿造前处理、酿酒酵母及陈酿过程[3-9]的相关香气物质起决定作用。研究发现葡萄酒中的挥发性物质主要包括酯类、醇类、醛酮类、萜烯类、硫醇类等，而关键呈香物质只是其中的小部分[10-11]。在葡萄酒风味物质形成过程中，酵母起主要作用，而不同酵母代谢途径不同，从而使葡萄酒具有不同的风味特征[12-14]。

由于葡萄原料、酿造工艺等相同或相似，使国内葡萄酒产品有严重的同质化现象，而程序化使用商业活性干酵母让葡萄酒没有地方特色。研究人员发现解决葡萄酒同质化问题，关键在于采用不同酵母酿造葡萄酒[15]，通过选择适应当地自然环境和葡萄品种的野生酵母酿造葡萄酒，使葡萄酒具有独一无二的地方特色[16]。

前期实验从广西毛葡萄产区分离筛选得到7 株野生葡萄酒酵母，经鉴定为汉逊酵母属的Hanseniaspora thailandica MSF1-4、伊萨酵母属的Issatchenkia terricola MG3-1、酿酒酵母属的Saccharomyas cerevisiae MSF8-1、汉逊酵母属Hanseniaspora thailandica MG4、汉逊酵母属的Hanseniaspora opuntiae MG6、汉逊酵母属的Hanseniaspora ocdidentalis MSF6-2、毕赤酵母属的Pichia pastoris MG1[17]。为探究该7 株野生葡萄酒酵母是否对本地葡萄品种有良好的酿造特性，本实验以7 株酵母菌发酵的‘桂葡3号’干白葡萄酒为材料，通过气相色谱-质谱联用对酒样的挥发性成分检测，采用主成分分析法对7 个酒样的特征香气成分进行分析比较，以期获得有地方特色的葡萄酒酵母,为酿造有南方特色的葡萄酒提供酵母资源。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

‘桂葡3号’葡萄：2016年12月15日采摘自广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所明阳双季葡萄示范基地园（东经108°14’31.76’’、北纬22°51’34.86’’），2014年3月种植，树势健壮，无病虫害发生。株行距为3.3 m×4.0 m，水平棚架栽培，采用“一字”型修剪方式，常规的水肥、喷药等田间管理[18]。果实可溶性固形物质量分数为18.1%，总糖质量浓度为212.9 g/L，可滴定酸质量浓度为9.23 g/L。

从广西河池市都安瑶族自治县青盛乡树龄50 a以上的野生毛葡萄植株的浆果筛选得到的7 株野生葡萄酒酵母：MSF1-4、MG3-1、MSF8-1、MG4、MG6、MSF6-2、MG1[17]，纯化后的单菌株在YPD液体培养基中活化1 d，将活化的菌液与30%无菌甘油以1∶1混合于1.5 mL离心管中，－80 ℃保藏。

商业葡萄酒酿酒酵母K1（Lalvin） 丹麦Lallemand公司。

YPD液体培养基：1 L培养基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨和20 g葡萄糖。YPDA固体培养基：1 L培养基中含有10 g酵母浸粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g琼脂。

1.2 仪器与设备

LRH-250-MS霉菌培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司；SW-CJ-IFD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DW-86L388超低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；5810R台式高速大容量冷冻离心机 德国Eppendorf公司；UV-2700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；HV-110高压灭菌锅 日本Hirayama 公司；SCION SQ 456-GC单四极杆气相色谱-质谱联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将－80 ℃冷冻保藏的7 株酵母于常温解冻后，28 ℃ YPDA固体培养基划线培养24 h后重复活化1 次。将菌落特征明显的酵母菌株接种于YPD液体培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养24 h，培养物6 000 r/min离心10 min[19]，加无菌水混合后离心洗涤2 次，收集菌体，4 ℃冷藏备用。

商业酵母K1参照使用说明进行活化。

1.3.2 发酵实验

将机械除梗破碎后的‘桂葡3号’葡萄醪，装入2.5 L发酵容器中，装液量为1.7 L，添加SO2至其质量浓度为60 mg/L（即体积分数为6%的H2SO3），接着将发酵容器放置在20～25 ℃静置[20]。将酵母分别按照107CFU/mL接入葡萄醪，28 ℃恒温发酵，每组3 个重复，采用二氧化碳失重法监测发酵进程，直至发酵结束（连续2 d的发酵液质量浓度变化小于2 g/L）。发酵结束后收集葡萄酒，将样品低温（4 ℃）3 000 r/min离心20 min后去除残菌，保留上清液于4 ℃冷藏[21]。

1.3.3 葡萄酒理化指标测定

参照GB 15037—2006《葡萄酒》分析测定葡萄酒中pH值、残糖、滴定酸（以酒石酸计）、挥发酸（以乙酸计）、乙醇体积分数、总酚等基本理化指标。

1.3.4 葡萄酒中挥发性香气成分提取检测[22]

顶空-固相微萃取条件：取8 mL样品置于20 mL顶空瓶中，顶空瓶中加入磁力转子，加入10 μL 100 μg/mL的2-辛醇作为内标。将老化后的75 μm CAR/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，45 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

色谱条件：色谱柱为DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始温度40 ℃保持4 min，以5.0 ℃/min升至90 ℃，保持0 min；再以10.0 ℃/min升至230 ℃，保持7 min；进样温度250 ℃，载气为He，流速0.8 mL/min，不分流。

质谱条件：电子电离源，发射电子流80 µA，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度200 ℃，质量扫描范围m/z30～500。

1.3.5 挥发性香气成分的定性与定量分析

定性分析：香气成分经气相色谱-质谱分析鉴定后，通过计算机谱库（NIST98）进行初步检索及资料分析，再结合文献[23-24]进行人工谱图解析，从而确认香气物质的各种化学物质。

定量分析：利用2-辛醇内标法进行定量。计算公式[25]如下：

1.4 数据统计与处理

通过SPSS 20.0（美国IBM公司）对酒样的理化指标进行单因素方差分析（多组间比较采用One-Way ANOVA法，P＜0.05，差异显著），并运用主成分分析对超过其阈值（大于1）的香气物质进行分析。

2 结果与分析

2.1 主要理化指标分析

表1 ‘桂葡3号’干白葡萄酒的理化指标Table 1 Physicochemical characteristics of ‘Guipu 3’ dry white wine

由表1可知，8 个酒样的pH值均在2.8～3.8之间。pH值表示葡萄酒中酸的强弱，对葡萄酒的稳定性和感官质量都起着非常重要的作用。葡萄酒的pH值一般在2.8～3.8之间，否则稳定性较差，各种病虫害微生物均易生长繁殖。

总酸即葡萄酒中的所有可滴定酸，为挥发酸和固定酸的总和。总酸含量对葡萄酒的色泽和风味均具有不同的影响[28]。由表1可知，7 株野生酵母均具有一定的降酸能力，其中MG3-1降酸最强，而MG1降酸最弱。乙酸对葡萄酒的风味影响是负面的[27]，由表1可知，所有酒样挥发酸质量浓度（以乙酸计）均小于1.2 g/L，符合GB 15037—2006要求，研究发现其质量浓度在0.2～0.7 g/L 左右较为适宜，而在0.7～1.1 g/L时，会让葡萄酒产生酸败感和溶剂味[26]。MG1酒样的滴定酸显著高于其他7 个酒样说明其产酸能力最强；MG3-1酒样滴定酸显著低于其他酒样，即其产酸能力最弱。

发酵结束后残糖量低，说明酵母对糖的代谢转化率高，发酵能力强[29]。乙醇发酵结束时残糖量若大于4 g/L则表明发酵不彻底，有酸败的危险[30]。由表1可以看出，8 个酒样残糖都较低，发酵都较彻底，没有酸败的风险。商用酵母K1的总酚含量最低，而单宁含量最高。

2.2 挥发性香气物质分析

通过对7 种酵母与商用酵母K1的发酵酒挥发性物质分析检测，共检测到68 种香气物质，其中包括3 种酸类、14 种醇类、22 种乙酯类、18 种其他酯类、6 种醛酮类、5 种萜烯类，见表2。

表2 不同酵母的发酵香气成分及含量Table 2 Aroma compounds of wines fermented with different yeast strains μg/L

续表2 μg/L

2.2.1 酯类

酯类赋予葡萄酒浓郁的果香[31]。由表2可知，酒样中共检测到40 种酯类，其中乙酯类22 种，其他酯类18 种。由图1可知，8 个酒样的香气物质主要为乙酯类。

MG1酒样中共有18 种乙酯类，占香气物质总含量79.03%；其他酯类9 种，占香气物质总含量5.96%。其中辛酸乙酯54 300.00 μg/L，占乙酯类总量42.93%，为K1辛酸乙酯含量的15.66 倍。与K1酒样相比，MG1酒样含有亚油酸乙酯、乳酸乙酯、十五酸乙酯和辛酸正丁酯，而K1酒样没有。其中亚油酸乙酯具有降低胆固醇和血脂的作用，可预防或减轻脉粥样硬化症。

MG4酒样中共有14 种乙酯类，占香气物质总含量76.80%；其他酯类5 种，占香气物质总含量8.29%。其中辛酸乙酯31 751.00 μg/L，占乙酯类总量46.05%，为K1辛酸乙酯含量的9.16 倍。与K1酒样相比，MG4酒样含有乙酸异戊酯，而K1酒样没有。

MSF1-4酒样中共有18 种乙酯类，占香气物质总量84.04%；其他酯类10 种，占香气物质总量2.35%。其中辛酸乙酯67 300.00 μg/L，占乙酯类总量42.41%，为K1辛酸乙酯含量的19.41 倍。与K1酒样相比，MSF1-4酒样含有亚油酸乙酯、己酸丙酯、十五酸乙酯、辛酸3-甲基丁酯和辛酸丙酯，而K1酒样没有。

MSF6-2酒样中共有20 种乙酯类，占香气物质总量78.91%；其他酯类12 种，占香气物质总量7.22%。其中辛酸乙酯48 900.00 μg/L，占乙酯类总量40.78%，为K1辛酸乙酯含量的14.10 倍。MSF6-2酒样含有硬脂酸乙酯、十五酸乙酯、辛酸正丁酯、亚油酸乙酯、顺式-2-丁烯酸乙酯、乙酸叶醇酯、水杨酸甲酯和辛酸-3-甲基丁酯，而K1酒样没有。

MSF8-1酒样中共有15 种乙酯类，占香气物质总量85.26%；其他酯类10 种，占香气物质总量5.83%。其中辛酸乙酯为58 800.00 μg/L，占乙酯类总量44.20%，为K1辛酸乙酯含量的16.96 倍。与K1酒样相比，MSF8-1酒样含有辛酸正丁酯、辛酸-3-甲基丁酯和辛酸丙酯，而K1酒样没有。

MG6酒样中共有17 种乙酯类，占香气物质总量73.94%；其他酯类10 种，占香气物质总量10.63%。其中辛酸乙酯为26 400.00 μg/L，占乙酯类总量40.91%，为K1辛酸乙酯含量的7.61 倍。与K1酒样相比，MG6酒样含有顺式-2-丁烯酸乙酯和乙酸异戊酯，而K1酒样没有。

MG3-1酒样中共有17 种乙酯类，占香气物质总量79.00%；其他酯类12 种，占香气物质总量5.44%。其中辛酸乙酯为48 100.00 μg/L，占乙酯类总量42.93%，为K1辛酸乙酯含量的13.87 倍。与K1酒样相比，MG3-1酒样含有乙酸叶醇酯、异戊酸乙酯、乙酯庚酯、辛酸正丁酯、水杨酸甲酯和乙酸异戊酯，而K1酒样没有。

2.2.2 醇类

醇类来源于酵母埃利希代谢途径和酵母对相应醛类还原过程的次级产物[32-34]。葡萄酒中的高级醇质量浓度低于300 mg/L时，能提高酒的复杂感；而质量浓度超过400 mg/L时，影响酒的感官品质[35]。由表2可知，MG1、MG4、MSF1-4、MSF6-2、MSF8-1、MG6、MG3-1、K1酒样中醇类分别有7、6、10、7、7、5、11 种和8 种。由图1和表2可知，醇类含量由高到低为MSF1-4＞MG3-1＞MSF6-2＞MG1＞K1＞MG4＞MG6＞MSF8-1。8 个酒样均含一定量苯乙醇，给酒样带来独特的紫罗兰香、丁香、茴香和玫瑰香味。

2.2.3 酸类

乙醇发酵过程带来挥发酸，其含量由葡萄汁的营养水平、发酵环境和酿造酵母[35]决定。葡萄酒中的有机酸给葡萄酒带来了奶酪味和脂肪味[37-38]。由表2可知，8 个酒样共检测出辛酸、月桂酸和癸酸3 种挥发酸。由图1可知，酸类含量由高到低为MSF1-4＞MG1＞MSF8-1＞MG3-1＞MSF6-2＞K1＞MG6＞MG4。

2.2.4 醛酮类

醛类主要来源于微生物的发酵。氨基酸在酶作用下转氨基或氧化脱氨基产生醛。由表2可知，8 个酒样共检测出癸醛、苯甲醛、壬醛、十二醛、大马士酮、香叶基丙酮，共4 种醛类2 种酮类。由图1可知，醛酮类含量由高到低为MG1＞MG3-1＞MSF8-1＞MSF6-2＞MSF1-4＞MG4＞MG6＞K1。

2.2.5 萜烯类

微生物合成萜烯类化合物是通过二磷酸异戊烯生物合成途径合成的[39-41]。二磷酸异戊烯之间结合形成香叶基二磷酸、法呢基二磷酸、香叶基二磷酸，分别是形成单萜、倍半萜和二萜的前驱物。其他萜烯类化合物来源于这3 个前驱物的环化或二次修饰。由于萜烯类化合物的香气阈值低，所以少量的萜烯对增加葡萄酒风味的丰富性起重要作用[42]。由表2可知，8 个酒样共检测出4-萜烯醇、香茅醇、芳樟醇、α-松油醇、玫瑰醚共5 种萜烯类。由图1可知，萜烯类含量由高到低为MG6＞K1＞MG1＞MG3-1＞MG4＞MSF6-2＞MSF1-4＞MSF8-1。

图1 ‘桂葡3号’干白葡萄酒各类香气物质的种类及其含量Fig. 1 Various classes of aroma components and their relative contents in ‘Guipu 3’ dry white wine

2.3 关键挥发性香气物质的OAV

表3 8 种酵母发酵‘桂葡3号’干白葡萄酒中挥发性物质的OAV（OAV＞1）Table 3 OAV values of volatile substances in ‘Guipu 3’ dry white wines fermented with eight yeasts (OAV ＞ 1)

为更准确地确定各种香气物质对葡萄酒的香气特征作用大小，通过查找文献得到相关香气物质的香气活力值（odour activity value，OAV），进一步分析探讨8 个酒样中的关键挥发性香气物质，OAV是由该物质的含量除以其阈值得到的[43]，研究发现OAV大于1的香气物质对葡萄酒的风味特征作用明显，且OAV越大对香气特征作用越明显，而OAV小于1的物质只起协香作用[44]。

由表3可知，共有19 种香气物质的OAV大于1，主要是脂类、醛类和萜烯类。其中10 种物质（辛酸、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、壬醛、4-萜烯醇、玫瑰醚）OAV大于10，（辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、壬醛、玫瑰醚）OAV大于100，2 种物质（己酸乙酯、辛酸乙酯）OAV大于1 000。这些物质被认为是发酵酒中必不可少的香气物质，且含量最多的是酯类，说明酯类是本实验酒样中的特征香气物质。

2.4 OAV的模拟计算结果

将葡萄酒中同类挥发性香气成分归为一组，并计算该组的OAV总和，即可对样品的香气轮廓进行模拟。由图2可知，采用不同的酵母发酵获得的‘桂葡3号’葡萄酒具有不同的香气特征，但是8 个酒样的香气特征均是由乙酯类决定。

图2 葡萄酒香气轮廓图（OAV＞1）Fig. 2 Wine aroma profile (OAV ＞ 1)

2.5 关键挥发性香气物质的主成分分析

由表4可知，2 个主成分的总贡献率为67.116%，其中主成分1的贡献率为48.564%，主成分2的贡献率为18.553%。

由图3可知，MG3-1、MG1、MSF6-2发酵实验组接近，其特征香气物质为乙酸苯乙酯、壬醛、4-萜烯醇、芳樟醇、1-辛醇、1-癸醇，这些物质具有花香、玫瑰香、橙子花香、水果香等香气；MG6的特征香气物质为乙酸异戊酯、香茅醇，这些物质具有香蕉、蔷薇花香、青草香；MSF8-1、K1、MG4发酵实验组接近，其特征香气物质为乙酸乙酯，其具有水果味；MSF1-4的香气特征物质为玫瑰醚、月桂酸乙酯、辛酸、癸酸、癸酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸甲酯，这些物质具有奶酪味、香蕉、菠萝、草莓、苹果、梨、橘子、花香等香气。其中K1、MG4发酵实验组最为接近，MG6、MSF1-4发酵实验组差异最大。以主成分1为基准，MSF1-4发酵酒明显区别于其他酒样，且其香气特征物质的OAV为37 038.67，香气物质质量浓度为188 818.00 μg/L，2 个指标在所有实验组中均排第1；以主成分2为基准，MG1明显区别于其他酒样，且其香气特征物质的OAV为30 376.81，香气物质质量浓度为160 058.30 μg/L，2 个指标在所有实验组中均排第2；说明MG1和MSF1-4发酵酒的香气评价最好。

图3 ‘桂葡3号’干白葡萄酒中OAV大于1的部分香气化合物PCA图Fig. 3 PCA graphs of aroma compounds (OAV ＞ 1) in ‘Guipu 3’ dry white wine

3 讨 论

通过筛选地方酵母酿造葡萄酒是增加葡萄酒的地域特征的有效方法。Lopes等[47]筛选的本土酿酒酵母MMf9发酵酒中具有紫罗兰、桉树、胡椒等独特的香气，且酒的品质明显优于商业酵母发酵酒。李艳等[48]从龙眼葡萄自然发酵筛选的酿酒酵母DHS-1发酵酒中苯乙醇含量高于安琪和BM45酵母发酵酒，能赋予葡萄酒紫罗兰香、茴香、丁香和玫瑰香味。徐丽萍[49]筛选出的高产酯假丝酵母属1#产酯量比本实验汉逊酵母属MSF1-4的少19.08%。

通过对7 株野生酵母酿造的‘桂葡3号’干白葡萄酒样，与商业酵母K1发酵酒比较研究，对发酵酒的挥发性香气物质进行分析检测，共得到68 种共5大类香气成分，包括3 种酸类、14 种醇类、22 种乙酯类、18 种其他酯类、6 种醛酮类、5 种萜烯类，比‘桂葡3号’葡萄浆果[15]多29 种香气物质，其中酯类多出19 种，且总含量是‘桂葡3号’浆果的5.9 倍。辛酸乙酯是干白葡萄酒的重要香味物质。本实验7 株野生葡萄酒酵母产辛酸乙酯能力均高于周金虎等[50]诱变筛选的高产辛酸乙酯地衣芽孢杆菌，其中汉逊酵母属MSF1-4是该菌株的17.26 倍。同时相对于商业酵母K1，7 株野生酵母菌均具有较强的产辛酸乙酯（白兰地香气）的能力，其中汉逊酵母属MSF1-4产辛酸乙酯能力最强；由于香气物质的总量和OAV均排第1和第2，因此香气评价最好的是汉逊酵母属MSF1-4和毕赤酵母属MG1；而商业酵母K1发酵酒的香气物质总量（71 912.33 μg/L）和种类（41 种）均最低。结果均表明，该7 株野生酵母具有良好的产香特性，有一定的商业酵母开发潜力，在后续工作中可进一步展开商业酵母开发应用相关实验，如组合菌株的酿造特性、产辛酸乙酯的基因及其控制机理等。