棒状乳杆菌发酵秘鲁鱿鱼糜凝胶特性的变化及其形成机理

陈晓倩，吴祖芳*，翁佩芳

（宁波大学海洋学院，应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211）

美洲大赤鱿（Dosidicus gigas）俗称秘鲁鱿鱼，为大洋性浅海种，属于茎柔鱼属，最大胴长1.5 m，最大体质量40 kg；其分布广泛，在秘鲁和智利沿岸及外海资源丰富，资源量在700～1 000万 t，是最具开发潜力的海产品之一[1]。秘鲁鱿鱼水分和粗蛋白质量分数分别为79.3%和17.2%，粗脂肪1.5%和灰分1.0%，是一种高蛋白、低脂肪的海产品[2]，然而其肉质粗糙，有酸、苦、涩味，不宜煮食[3]，目前主要作为经济鱼类的优良钓饵或者鱼粉。为提高其经济价值，有人对它进行烤制加工[4]或鱿鱼丝加工[5]研究，也有人利用鱿鱼皮制备胶原蛋白肽[6]。

鱼糜制品作为一种具有良好凝胶弹性口感和独特风味的优质蛋白产品，深受国内外广大消费者喜欢。鱼糜凝胶形成的主要成分为肌原纤维蛋白，由50%～55%的肌球蛋白、20%肌动蛋白、肌动球蛋白以及少量原肌球蛋白和肌浆蛋白组成[7]。秘鲁鱿鱼肌肉组织中富含肌原纤维蛋白，因此，为提高秘鲁鱿鱼经济价值，可将其绞成鱼糜进行加工。

迄今为止，利用乳酸菌发酵加工鱿鱼的研究仅有少量报道[8-9]，利用乳酸菌发酵其他低值水产品形成鱼糜凝胶则有相关研究报道[10-17]，而利用乳酸菌发酵鱿鱼糜形成凝胶的研究则鲜见报道。王乃富等[10]对乳酸菌发酵鳙鱼肉糜菌相与品质影响的研究发现，乳酸菌可增强鳙鱼肉糜的凝胶强度和白度并促进鳙鱼肉糜蛋白质的降解。陈正荣等[11]研究干酪乳杆菌发酵工艺条件对鱼糜品质影响，结果表明成熟后的发酵鱼糜，感官可接受性高。因此，利用乳酸菌对秘鲁鱿鱼进行发酵加工形成鱼糜凝胶具有可行性及广阔的发展前景。

本课题组从浙东腌制菜中分离到1 株棒状乳杆菌（编号Lz153）[18]，该菌可抑制常见食品污染微生物、降解亚硝酸盐、不产生H2O2和H2S，且能产生独特的风味物质，可以作为发酵食品安全生产菌株。本研究通过测定棒状乳杆菌Lz153发酵秘鲁鱿鱼糜凝胶强度、硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性等凝胶特性指标和发酵过程中化学作用力变化规律，以及观察肌原纤维蛋白在发酵过程中的变化情况，旨在揭示发酵秘鲁鱿鱼糜凝胶形成的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秘鲁鱿鱼 宁波飞润海洋生物科技有限公司；食盐、白砂糖、玉米淀粉等辅料 宁波加贝超市；菌株：棒状乳杆菌Lz153（Lactobacillus coryniformis Lz153） 宁波大学食品生物技术实验室保藏。

MRS肉汤、MRS培养基 杭州微生物试剂有限公司；5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DNTB） 上海晶纯生化科技股份有限公司；β-巯基乙醇、考马斯亮蓝、牛血清蛋白标准品索莱宝生物技术有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾、尿素、乙二胺四乙酸（edetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、冰醋酸、乙醇、甲醇 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-40B I型立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；QYC-2102C全温振荡培养箱 宁波江南仪器厂；XHF-D内切式匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C pH计 上海精密科学仪器有限公司；TA.XT Plus质构仪 英国SMS公司；高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；DYCZ-25D型电泳仪 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂制备

在MRS肉汤中活化棒状乳杆菌Lz153，37 ℃摇床培养24 h后，按1%接种量重复活化3 次，8 000×g离心10 min（4 ℃）后收集菌体，用生理盐水重悬至菌液浓度约为107CFU/mL。

1.3.2 秘鲁鱿鱼糜、乳酸菌发酵鱿鱼糜凝胶制备

冷冻秘鲁鱿鱼足去皮及结缔组织，取肌肉组织，自来水漂洗[19]3 次，沥水搅打成糜冷冻备用。冷冻鱼糜解冻，加入辅料盐1.5%、糖5%、玉米淀粉1%，并按1%的量接种发酵剂，真空包装，30 ℃发酵培养，发酵时间分别为24、30、36、42 h和48 h。

1.3.3 肌原纤维蛋白提取

取不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）1 g，加入5 mL含有50 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸盐缓冲液，冰水浴中匀浆，4 ℃、5 000×g离心15 min，弃上清液，按上述步骤重复操作2 次。收集沉淀加入10 mL 0.6 mol/L NaCl溶液，冰水浴中匀浆，4 ℃、10 000×g离心10 min，上清液用纱布过滤去除结缔组织后加入3 倍体积的冷蒸馏水稀释蛋白溶液使肌原纤维蛋白沉淀，4 ℃、10 000×g离心20 min收集肌原纤维蛋白沉淀。用0.6 mol/L NaCl溶液溶解后将肌原纤维蛋白贮存于4 ℃，需在18 h内使用。

1.3.4 pH值的测定

取不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）2 g，加18 mL去离子水，均质后用PHS-3C pH计0～48 h内每隔6 h测定其pH值。

1.3.5 凝胶特性的测定

1.3.5.1 凝胶强度

将不同发酵时间的鱼糜凝胶切成约25 mm置于TA.XT Plus质构仪试验台上，压缩力模式，探头P0.5S，测中速率1 mm/s，形变量50%。探头对其下压刺穿，穿刺曲线上的第1个峰为破断强度。凝胶强度按式（1）计算：

1.3.5.2 全质构模式

测定不同发酵时间段鱼糜凝胶样品弹性、硬度、咀嚼性和胶黏性，探头为P36，测中速率2 mm/s，形变量50%。

1.3.6 化学作用力的测定

1.3.6.1 离子键、氢键及疏水相互作用

参考Gomez-Guillen等[20]方法，取1.3.2节不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）2 g，分别加入10 mL不同处理液：0.05 mol/L NaCl（SA）溶液、0.6 mol/L NaCl（SB）溶液、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L 尿素（SC）溶液和0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（SD）溶液，均质后4 ℃静置1 h，10 000×g离心15 min。离子键含量以溶解于SB溶液与SA溶液中蛋白质含量差表示；氢键含量以溶解于SC溶液与SB溶液中蛋白质含量差表示；疏水相互作用含量以溶解于SD溶液与SC溶液中蛋白质含量差表示。上清液中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

1.3.6.2 二硫键

总巯基含量测定：取不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）1 g，设3 组平行，分别加入30 mL处理液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0），匀浆机均质后室温连续搅拌6 h，12 000×g离心20 min去除沉淀。各取3 mL上清液，加入0.3 mL 0.1%的DTNB溶液[22-23]，40 ℃水浴25 min，分光光度计412 nm波长处测定上清液的吸光度，以摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm）计算。总蛋白含量为样品直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中蛋白质量，蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。

二硫键含量测定：取不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）1 g，设3 组平行，分别加入30 mL处理液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，0.15 mol/L β-巯基乙醇，pH 8.0），匀浆机均质后室温连续搅拌6 h，添加50 g/100 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液至最终质量分数为5%，继续搅拌2 h后5 000×g离心收集沉淀。沉淀部分用5 g/100 mL的TCA溶液漂洗2 次去除残留的β-巯基乙醇，再溶解于20 mL不含β-巯基乙醇的处理液，12 000×g离心20 min收集上清液。上清液中巯基含量的测定方法同总巯基含量，巯基含量和二硫键含量分别按式（2）、（3）计算：

式中：A412nm为吸光度；D为稀释倍数；c为蛋白质量/mg；V为溶于0.5 mol/L NaOH溶液的体积/mL。

1.3.6.3 溶解率

参考Benjakul等[24]方法。取不同发酵时间的鱼糜凝胶（发酵0 h为对照组）1 g，加入20 mL 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含1 g/100 mL SDS、8 mol/L尿素和体积分数2% β-巯基乙醇，pH 8.0），均质后混合物于100 ℃加热2 min后，于室温搅拌4 h，10 000×g离心30 min。取上清液10 mL，添加50 g/100 mL的冷TCA至终质量分数为10%，混合液于4 ℃放置18 h，10 000×g离心30 min，沉淀物用10 g/100 mL TCA冲洗并溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中。总蛋白含量为鱼糜凝胶直接溶解于0.5 mol/L NaOH溶液中测得的蛋白质含量。溶解率表示为溶解于溶剂中的蛋白质占总蛋白含量的百分比。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

模板质量直接关系到模板的顺利拼装及墩身外观质量，安全前应严格对模型进行验收检查，不合要求的坚决返工补修。检查验收完毕后应对模板进行试拼，测量模板误差对垂直高度的影响，检查模板拼装误差。可提前采取措施减少模板在墩身上的调整量。安装模板前，应先确定爬架悬挂预埋件位置，通过爬架系统上设置的模板可滑动调节系统，快速完成模板安装。

1.3.7 肌原纤维蛋白分析

参考李娜等[25]方法，将1.3.3节蛋白样品与2×上样缓冲液（含β-巯基乙醇）等体积混合，100 ℃加热10 min，常温5 000×g离心1 min，采用4%浓缩胶和10%分离胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），进样量10 μL，初始电压80 V，待样品进入分离胶后改为110 V。电泳完成采用考马斯亮蓝R250染色，醋酸乙醇溶液进行脱色。

1.4 数据处理

实验重复至少3 次以上。采用SPSS进行统计分析，单因素ANOVA方差分析，Duncan’s组间差异显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中pH值的变化

从图1可知，未经发酵的秘鲁鱿鱼糜pH值接近中性，发酵24 h后pH值大幅度降低至5.17，随后一直小幅度下降至4.57，说明乳酸菌能利用鱿鱼肉糜快速繁殖，在发酵24 h后产生了大量有机酸。

图1 发酵过程中鱿鱼糜凝胶pH值的变化Fig. 1 Change in pH of giant squid surimi gel during fermentation

2.2 鱼糜凝胶特性在发酵过程中的变化

表1 秘鲁鱿鱼糜发酵过程中凝胶特性变化Table 1 Changes in gel properties during fermentation of giant squid surimi

由表1可知，未经发酵的对照组没有形成凝胶，无法通过质构仪测得其凝胶特性指标。发酵24 h后，鱼糜凝胶硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性达到最大，随后该几项指标持续下降，其中硬度、胶黏性和咀嚼性在24～30 h阶段都有明显下降，在随后发酵时间里下降变化并不明显，而弹性下降变化显著。在发酵24 h凝胶强度为1 058.925 g·mm，30 h大幅度增加，达到1 504.479 g·mm，至36 h凝胶强度稍有下降至1 468.134 g·mm，到42 h呈较大幅度减少。综合以上结果，24～36 h发酵阶段内的鱿鱼糜凝胶特性最佳。

2.3 发酵过程中化学作用力的变化

2.3.1 离子键、氢键及疏水相互作用的变化

离子键是蛋白质分子所带电荷使蛋白分子间相互吸引或者排斥的作用力，参与肌球蛋白分子尾部螺旋结构的相互交联过程；氢键是弱偶极键，在蛋白质凝胶体系中的数量极大，是增加凝胶强度的重要化学键，对稳定结合水起重要作用。疏水相互作用是当蛋白质变性展开时，非极性多肽会暴露于分子表面，内部肌球蛋白分子尾部的疏水结构也暴露于水中，相邻多肽非极性片段的疏水部分开始紧密结合，发生的疏水相互作用，可以引起蛋白质凝集形成凝胶[26]。

图2 离子键、氢键及疏水相互作用随发酵时间的变化Fig. 2 Changes in contents of ion bond, hydrogen bond and hydrophobic interaction during fermentation

如图2所示，离子键在发酵鱿鱼糜凝胶形成过程中含量总体大幅度下降，最初质量浓度为1.706 g/L，经48 h发酵，质量浓度持续大幅度减少至0.196 g/L；而氢键初始含量比离子键少，在24 h稍有减少后大幅增多，到36 h质量浓度达到最大，为2.634 g/L，随后至48 h稍有下降；疏水相互作用在该过程中含量总体均高于离子键和氢键，0～30 h阶段含量持续较大幅度增大，至30 h质量浓度达到最大，为5.397 g/L，随后36、42 h虽然有所下降但含量依然高于0 h未经发酵组。上述结果表明，发酵过程中离子键对凝胶形成维持并不起作用，氢键和疏水相互作用是维持凝胶形成的主要作用力。

2.3.2 二硫键的变化

图3 二硫键随发酵时间的变化Fig. 3 Change in disul fide bond content during fermentation

如图3所示，随着发酵时间延长，二硫键含量呈逐渐增多趋势，在24、30 h含量较少，只有0.43 μmol/g和0.63 μmol/g，到36 h骤增至2.65 μmol/g，随后增长速率放缓，至48 h含量为3.59 μmol/g，高于对照组。二硫键主要形成于30～36 h发酵阶段，作用于鱿鱼糜凝胶形成及维持。

2.3.3 非二硫共价键的变化

非二硫共价键是凝胶形成过程肌肉组织中的内源性谷氨酰胺转氨酶催化形成以ε-（γ-Glu）-Lys为主的共价交联键，促进蛋白质凝胶网络的形成。含SDS、尿素和β-巯基乙醇的混合溶剂能够断裂鱼糜凝胶中除了非二硫共价键外的所有化学键，因此溶解率与形成的ε-（γ-Glu）-Lys等非二硫共价键的含量呈负相关。

图4 溶解率随发酵时间的变化Fig. 4 Change in solubility during fermentation

如图4所示，发酵过程中，溶解率随发酵时间延长逐渐降低，说明非二硫共价键在该过程中逐渐形成，尤其是30～36 h阶段，溶解率从17.16%大幅度降低至9.45%，非二硫共价键主要在该阶段形成。所以，非二硫共价键也形成于30～36 h，同样作用于鱿鱼糜凝胶形成和维持。

2.4 肌原纤维蛋白SDS-PAGE分析

图5 发酵过程中肌原纤维蛋白变化SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the changes of myofibrillar proteins during the fermentation process

如图5所示，肌原纤维蛋白中肌球蛋白重链和肌动蛋白发酵至24 h后条带强度开始减弱，且随着发酵时间延长，肌球蛋白至36 h已完全降解。同时，在发酵24 h后，于100～135 kDa范围内出现新的盐溶性蛋白条带，在30～42 h发酵阶段条带呈增强趋势，至48 h逐渐降解。文献[27]报道，酸性条件下肌肉组织中酸性内源蛋白酶可被激活，将肌动球蛋白降解；肌动球蛋白的消亡以及新的盐溶性蛋白条带出现，结合2.2节结果分析推断，新产生的蛋白条带可能是由肌球蛋白重链被内源蛋白酶降解产生，是形成弹性凝胶体的重要组成部分。

3 讨 论

pH值通过影响肌原纤维蛋白氨基酸侧链电荷分布，改变蛋白质分子间的相互作用，可导致蛋白质结构及诱导凝胶形成的化学作用力发生变化[28]。肌原纤维蛋白等电点约为5.0～5.5[29]，当pH值接近肌原纤维蛋白等电点时，氨基酸侧链正负电荷互相中和，蛋白质分子间离子键含量减少，这有利于疏水相互作用的增强与蛋白分子间的氢键作用增强，而远等电点时，离子键含量增多，蛋白分子间形成斥力，疏水相互作用和蛋白分子间的氢键作用减弱，蛋白与溶质水间的氢键形成。同时，蛋白分子结构的变化会暴露出更多，活性巯基被氧化形成二硫键，以及在内源性谷氨酰胺转氨酶的催化下会形成以ε-（γ-Glu）-Lys为主的共价交联键。这一系列的变化都会影响鱼糜凝胶品质的形成。

在发酵秘鲁鱿鱼糜过程中，棒状乳杆菌Lz153大量繁殖产酸，pH值降低接近等电点，因此，24～36 h内发生离子键迅速减少、氢键和疏水相互作用含量增大的变化。30～36 h阶段二硫键和非二硫共价键含量均发生大幅度增加，这可能是因为鱿鱼组织中的内源蛋白酶在酸环境中被激活产生作用，导致蛋白质结构发生变化，暴露出更多活性巯基、赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸残基上的γ-羧酰胺基，使得二硫键和非二硫共价键大量生成，同时，SDS-PAGE图谱也出现肌动蛋白被逐渐降解、肌球蛋白重链至36 h完全降解并在30 h新蛋白条带明显生成的结果。36 h后，肌球蛋白重链被完全降解，同时氢键和疏水相互作用含量稍有下降，而二硫键和非二硫共价键则有增无减。许艳顺等[30]研究发酵鲢鱼糜凝胶形成机理和刘海梅等[31]探究鲢鱼糜凝胶形成过程中化学作用力及蛋白质构象的变化中，疏水相互作用、二硫键和非二硫共价的键变化与本研究有同样结果，而肌原纤维蛋白的变化与胡永金[32]对淡水鱼糜发酵及凝胶形成机理研究的实验结果类似。凝胶特性的测定结果（24～36 h凝胶特性最佳，随后开始劣化）也印证了以上的推断。本研究显示，鱿鱼糜凝胶是肌原纤维蛋白和新出现的蛋白分子在氢键、疏水相互作用、二硫键和非二硫共价键的共同作用下形成并维持，雷雨等[33]的研究同样表示，非二硫共价键、疏水键及氢键可以促使鱼糜形成更致密、均匀的三维网状空间结构。

4 结 论

棒状乳杆菌Lz153能在秘鲁鱿鱼糜中快速繁殖产酸并使秘鲁鱿鱼糜形成良好的凝胶体。该凝胶体在发酵24～36 h范围内品质最佳随后劣化。化学作用力变化规律为在发酵过程中离子键含量大幅度减少，氢键和疏水相互作用含量分别在发酵36 h和30 h达到最大值，二硫键和非二硫共价键含量随发酵时间延长而呈增多的趋势；SDS-PAGE图谱显示肌原纤维蛋白经发酵后，肌动蛋白和肌球蛋白重链均随着发酵被降解，36 h后肌球蛋白条带已完全消失，同时经发酵24 h后分子质量在100～135 kDa范围出现了新的盐溶性蛋白条带，发酵至48 h也被降解。肌球蛋白和新出现的蛋白参与发酵鱿鱼糜凝胶网络结构的形成，氢键、疏水相互作用、二硫键和非二硫共价键是形成和维持发酵秘鲁鱿鱼糜凝胶网络的主要作用力。由于化学作用力对其作用的过程比较复杂，乳酸菌发酵鱿鱼糜凝胶形成的机理有待从蛋白质二级结构变化角度进一步研究。