高效液相色谱-示差折光检测法测定磺丁基醚-β-环糊精的含量

2019-03-11李闻新张福林

实用药物与临床 2019年1期

李闻新，部实，张余，刘丹，张福林

0 引言

磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)是一种高水溶性的β-环糊精(β-CD)衍生物，能与药物形成非共价键包合物，从而提高药物的溶解性、稳定性、安全性和生物利用度，并能掩盖药物的不良气味[1-2]。与β-CD相比，其具有更好的水溶性，且溶血作用小、肾毒性低，是一种应用前景非常广阔的新型药用辅料[3-4]。SBE-β-CD是由1，4-丁烷磺内酯(1，4-BS)在碱性条件下与β-CD的2，3，6位碳上的羟基发生取代反应得到的[5-6]。由于β-CD是由7个吡喃葡萄糖通过α-(1、4)糖苷键连接而成，有21个可能发生取代反应的位点，因此，通过该反应所得到的产物是非常复杂的混合物。20世纪90年代，美国Cydex公司开发出了取代度(Degree of substitution，DS)为7的SBE7-β-CD，商品名为Captisol。而我国起步较晚，仍处于研发阶段，尚没有商品上市。

1 材料与方法

1.1 试药乙腈(色谱纯，Fisher Scientific)；甲醇(色谱纯，Fisher Scientific)；乙酸(色谱纯，Dikma公司)；硝酸钾(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；水为超纯水；SBE7-β-CD对照品为USP标准品；SBE7-β-CD(批号：20131101、20131102、20131103、20131104、20131105、20131106，唐山市第二医院中心实验室提供)；4-羟基丁磺酸钠和二磺烷基化醚钠(唐山市第二医院中心实验室提供)；β-CD对照品(中国药品生物制品检定所)；1,4-丁烷磺内酯对照品(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.2 仪器高效液相色谱仪(1260 Infinity，Agilent Technologies)，配有四元泵、在线脱气机，示差折光检测器(1260 Infinity，Agilent Technologies)；KQ5200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水系统(Millipore公司)；FiveEasy型pH计(Mettler Toledo)；FRESCO21型冷冻微量离心机(Thermo Scientific)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.3 色谱条件色谱柱：Phenomenex PolySep-GFC-P3000(7.8 mm×30 cm)凝胶柱；柱温35 ℃；检测器温度35 ℃；流动相：乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(35∶65)；流速1.0 ml/min；进样量10 μl。

1.4 溶液的配制

1.4.1 对照品储备液取SBE7-β-CD对照品约75 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，用流动相溶解、定容，得1.5 mg/ml的对照品储备液。

1.4.2 供试品溶液取SBE7-β-CD供试品约10 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，用流动相溶解、定容，得1.0 mg/ml的供试品溶液。取1 ml供试品溶液在14 000 r/min、20 ℃下离心10 min，取上清液进样。

1.4.3 空白溶剂及杂质溶液空白溶剂：流动相即为空白溶剂。杂质溶液：分别取4-羟基丁磺酸钠、二磺烷基化醚钠、β-环糊精各约1 mg，并取少量1,4-丁烷磺内酯，分别置于2 ml离心管中，用流动相稀释至1.0 mg/ml，分别量取0.3 ml，用流动相稀释至0.3 mg/ml，即得各杂质溶液。供试品与各杂质的混合溶液：分别量取1.0 mg/ml的4-羟基丁磺酸钠、二磺烷基化醚钠、β-环糊精杂质溶液各0.25 ml，混合，再加入少量1,4-丁烷磺内酯溶液和SBE7-β-CD供试品1 mg，用流动相稀释至1 ml，混匀，即得。所有溶液需在14 000 r/min、20 ℃下离心10 min，取上清液进样。

1.5 方法学验证

1.5.1 专属性按“1.4.3”项下方法配制空白溶剂、4-羟基丁磺酸钠、二磺烷基化醚钠、β-环糊精、1,4-丁烷磺内酯、SBE7-β-CD对照品溶液及SBE7-β-CD供试品与杂质的混合溶液，按“1.3”项下方法分别进样，记录色谱图。

1.5.2 检测限和定量限取SBE7-β-CD对照品储备液并逐级稀释，进样测定，记录色谱图，分别以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品的量为检测限和定量限。

1.5.3 标准曲线取SBE7-β-CD对照品储备液并逐级稀释成1.4、1.2、1.0、0.9、0.7、0.5 mg/ml的对照品溶液，分别进样，记录色谱图和峰面积，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归。

1.5.4 精密度和准确度取20131103批供试品，平行配制6份1.0 mg/ml的供试品溶液，分别进样分析，记录色谱图和峰面积，计算含量测定结果的RSD。回收率按如下公式计算：测得量/平均值×100%，计算6份供试品的回收率。

1.5.5 溶液稳定性取供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8 h进样分析，记录色谱图和峰面积。

1.6 含量测定取各批次供试品，制备供试品溶液，进行测定，记录色谱图和峰面积，以标准曲线法计算供试品的含量。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 SBE7-β-CD、二磺烷基化醚钠、4-羟基丁磺酸钠、β-环糊精、1,4-丁烷磺内酯的保留时间分别为6.850、7.709、8.040、8.580、11.326 min，SBE7-β-CD与各杂质峰的分离度均不小于1.94，且空白溶剂无干扰，表明该方法专属性良好。见图1。

图1 专属性色谱图

注：a.空白溶剂，b.β-环糊精，c.4-羟基丁磺酸钠，d.二磺烷基化醚钠，e.1,4-丁烷磺内酯，f.对照品，g.样品和杂质的混合溶液

2.1.2 检测限和定量限 SBE7-β-CD的检测限和定量限分别为0.32 μg和0.48 μg。见图2、图3。

图2 SBE7-β-CD检测限色谱图

图3 SBE7-β-CD定量限色谱图

2.1.3 标准曲线 SBE7-β-CD的标准曲线方程为：Y=73 156 X-841.92，r=0.999 8，所得结果见表1。表明SBE7-β-CD在0.498 5～1.495 mg/ml范围内线性关系良好。

表1 SBE7-β-CD的线性范围

2.1.4 精密度和准确度 6份供试品溶液含量测定结果的RSD为1.4%，表明该方法的精密度良好。回收率为97.8%～101.2%，表明该方法的准确度良好。见表2。

表2 SBE7-β-CD回收率和精密度测定结果

2.1.5 溶液稳定性同一份供试品溶液在室温下放置0、2、4、8 h时进样分析，与放置0 h相比，供试品浓度的相对误差(RE)为-0.4%～4.9%，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。见表3。

表3 SBE7-β-CD溶液稳定性测定结果

2.2 含量测定 6批供试品的含量在95.8%～99.3%。见表4。

表4 含量测定结果

3 讨论

3.1 硝酸钾对色谱峰形的影响本实验比较了流动相中不加硝酸钾、加0.1 mol/L硝酸钾、加0.2 mol/L硝酸钾对色谱峰的影响，见图4。由图4可知，向流动相中添加硝酸钾可以明显改善色谱峰前延的情况，但随着加入硝酸钾量的增大(>0.1 mol/L)，色谱峰形的改善并不明显，因此，本实验选择0.1 mol/L的硝酸钾。

图4 硝酸钾对色谱峰形的影响

注：a.乙腈-水(20∶80)，流速：0.65 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)，流速：0.7 ml/min；c.乙腈-0.2 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min

3.2 乙酸对分离的影响由于4-羟基丁磺酸钠(M=176.17)、二磺烷基化醚钠(M=334.32)均为负离子钠盐，而Phenomenex PolySep-GFC-P3000凝胶柱的填料本身带有负电荷[2]，因此这两种杂质最先出峰。所以尝试加入酸，使其转化为酸的形式，延长保留时间，从而改善分离。本实验考察、比较了在乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)流动相中加入0.5%的乙酸与不加乙酸的效果。结果显示，两种条件下主峰与相邻杂质峰的出峰时间之差分别为0.773 min和0.771 min，见图5。表明乙酸对分离的影响不大。因此，选择不向流动相中添加乙酸。

图5 乙酸对分离的影响

注：a.乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)，流速：1.0 ml/min；b.乙腈-0.1 mol/L硝酸钾溶液(0.5%乙酸)(20∶80)，流速：1.0 ml/min

3.3 有机相体系的考察甲醇体系：本实验比较了甲醇-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)(流速0.7 ml/min)和甲醇-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(35∶65)(流速0.7 ml/min)两种流动相对分离的影响。结果显示，两种流动相对分离的影响不大，且分离效果不理想，见图6。考虑到甲醇-水混合溶液在50∶50比例时黏度较大，使柱压增高，可能超过凝胶柱的使用范围，故放弃使用甲醇-水作流动相。

图6 不同比例的甲醇对分离的影响

注：a.甲醇-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)，流速：0.7 ml/min；b.甲醇-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(35∶65)，流速：0.7 ml/min

乙腈体系：本实验比较了乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(20∶80)(流速1.0 ml/min)和乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(35∶65)(流速1.0 ml/min)两种流动相对分离的影响。结果显示，主峰与相邻杂质峰的分离度分别为2.12和1.94，均>1.5，且后者条件下整体出峰时间较早，见图7。在能达到分离目的前提下，选择乙腈-0.1 mol/L硝酸钾水溶液(35∶65)作为流动相。