雷公藤多苷对Pristane诱发性红斑狼疮外周血T细胞漂移及细胞因子的影响

周 娇，张小乔，戴红伟

0 引言

系统性红斑狼疮是一类细胞免疫和体液免疫异常的全身多系统受累的自身免疫性疾病，自身免疫调节功能紊乱是其主要病因，表现为自身反应性T细胞大量增生和B细胞功能亢进，细胞因子表达异常、自身抗体产生和免疫复合物清除障碍而引起机体多个器官损伤[1]。有研究发现，系统性红斑狼疮患者Th及Tc细胞亚群失衡，这种自身免疫调节功能紊乱与Tc1、Tc2细胞漂移有关[2-3]。在对正常健康人群流行病学调查中发现，Tc1和Th1细胞百分比、Th1/Th2比值和Tc1/Tc2比值均显著低于系统性红斑狼疮活动期患者，这进一步证实T细胞漂移及细胞因子改变是系统性红斑狼疮发病的重要机制[4-5]。鉴于此，研究药物对T细胞漂移及细胞因子的影响有助于该病的治疗。本实验通过Pristane腹腔注射诱导BALB/c裸鼠系统性红斑狼疮动物模型，再用雷公藤多苷灌服的方法观察其对该模型鼠外周血T细胞漂移及细胞因子的影响，分析雷公藤多苷调控与系统性红斑狼疮发病机制密切相关的T细胞漂移过程，为临床治疗系统性红斑狼疮提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物与分组 雌性清洁级BALB/c裸鼠24只，体重(26.5±1.0)g，购自广东省医学实验动物中心，质量合格证：SCXK(鄂)2018-001，在随州医院动物中心标准实验室完成实验，设施合格证编号：SYXK(鄂)2018-001。遵循3R原则，保证动物福利，造模前1周放空气层流柜中无菌饲养，饲料和饮用水灭菌处理，饲料中加入红霉素。动物用随机数字表法随机均分为模型组、0.25 mg/(kg·d)组、0.5 mg/(kg·d)组和1 mg/(kg·d)组，每组6只。

1.2 仪器及试剂 雷公藤多苷片(广东华南药业集团有限公司，Z44023753)；Pristane注射液(Sigma,批号:RNBB4308V)；RPMI 1640培养液购于Gibco公司(美国)；淋巴细胞分离液购于上海试剂厂；流式细胞仪购于PaTec公司(德国)；CIMFITC、CD3TRI-COLOR、CD4TRI-COLOR和CD8R-PE均购于Cahag公司(美国)；CD4+-FITC、CD8+-PE-CY-5购于Bection Dickinson公司(美国)。

1.3 造模和干预 Pristane诱发Balb/c裸鼠系统性红斑狼疮造模方法参照文献[6]，将裸鼠24只单次腹腔注射0.5 ml Pristane，3个月后可建立稳定的系统性红斑狼疮动物模型。实验动物干预性用药根据人与实验动物用药换算公式计算，治疗组雷公藤多苷用药量分别为0.25、0.5、1 mg/(kg·d)。模型组按1 ml/鼠灌服0.9%生理盐水对照。

1.4 流式细胞术检测Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴细胞亚群分类及细胞因子 分别于治疗前、治疗3个月和6个月从尾静脉采血，采用直接荧光标记的流式细胞术检查治疗不同阶段Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴细胞亚群分类。检测时先将外周血制备成PBMNC悬液，然后取75 μl加入300 μl的无小牛血清的RPMI 1640液中，再分别加入Ionomycin液10 μl，BFA液14 μl，PMA液46 μl混匀，置于通有5%CO2、37 ℃的培养箱中培养5 h。取标记为A1、A2、A3、A4的流式细胞仪试管4只，各加入100 μl孵育好的上述培养液。A1、A2、A3、A4流式细胞仪试管中加入Reagan A固定液50 μl，混匀后避光、室温下二次孵育。孵育20 min后，每支试管中加入PBS 2 ml，混匀后离心(离心力：1 000×g，5 min)，弃上清，分别加入Reagan B 50 μl混匀，避光、室温下孵育。孵育20 min后向管中加入PBS 2 ml，混匀后离心(离心力：1 000×g，5 min)，弃上清。每管中分别加入相应抗体10 μl(A1:Anti-IFN-γ-PE,A2:Anti-IL-2-PE,A3:Anti-IL-4-PE,A4:Anti-IL-10-PE)，混匀后避光、室温下孵育。孵育20 min后，再次向A1、A2、A3、A4管中加入PBS 2 ml，混匀后离心(离心力：1 000×g，5 min)，弃上清，加1 ml PBS重悬细胞，然后上机检测外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2淋巴细胞亚群分类及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。

2 结果

2.1 Tc淋巴细胞亚群分类及比值变化 模型组Tc1、Tc2百分比和Tc1/Tc2比值在治疗1个月和3个月时与同组治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)组治疗3个月时Tc2细胞百分比较治疗前、模型组同期和治疗1个月时明显升高(P<0.05)，而Tc1百分比和Tc1/Tc2比值降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)组和1 mg/(kg·d)组在治疗1个月和3个月时Tc1百分比和Tc1/Tc2比值较治疗前和模型组同期明显降低(P<0.05)，而Tc2细胞百分比明显升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)，1 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组和0.5 mg/(kg·d)组同期比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 治疗不同阶段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量变化比较 模型组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10治疗前后无明显变化，治疗1个月和3个月时与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)组在治疗3个月时较治疗前、模型组同期和治疗1个月时明显降低(P<0.05)，但IL-4、IL-10明显升高(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)组和1 mg/(kg·d)组IFN-γ、IL-2在治疗1个月和3个月时较治疗前和模型组同期明显降低(P<0.05)，IL-4、IL-10明显升高(P<0.05)，且0.25 mg/(kg·d)组、0.5 mg/(kg·d)组、1 mg/(kg·d)组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 治疗前和治疗1个月、3个月时Tc淋巴细胞亚群分类及比值比较(n=6，%)

注：与模型组比较，*P<0.05；与治疗前比较，#P<0.05；与0.25 mg/(kg·d)组比较，△P<0.05；与0.5 mg/(kg·d)组比较，▽P<0.05

2.3 Tc淋巴细胞亚群分类及比值变化比较 模型组Th1、Th2百分比和Th1/Th2比值治疗1个月和3个月时与同组治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。0.25 mg/(kg·d)组治疗3个月时Th2细胞百分比升高、Th1百分比和Th1/Th2比值较治疗前、模型组同期和治疗1个月时降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)组和1 mg/(kg·d)组在治疗1个月和3个月时Th1百分比和Th1/Th2比值较治疗前、模型组同期和治疗1个月时降低，Th2细胞百分比升高(P<0.05)。且0.5 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组同期比较差异有统计学意义(P<0.05)，1 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组和0.5 mg/(kg·d)组同期比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

系统性红斑狼疮是以女性多发的具有性别偏好性的自身免疫功能紊乱性疾病，男女的发病性别比为1∶7～1∶9[7]。目前，虽然对系统性红斑狼疮的研究相对深入，但其发病机制及病因均未完全肯定，免疫异常、内分泌失调、感染、遗传和环境等多因素相互作用而引起患者机体免疫体系的功能失调是其发病的根本原因[8-12]。研究表明，在系统性红斑狼疮活动期，存在T细胞功能失调和B细胞多克隆活化现象，二者相互作用产生大量自身抗体，在与抗原结合后，形成免疫复合物沉积于组织器官，造成不同程度的免疫性损伤[13-14]。且系统性红斑狼疮在不同时期，患者外周血Tc与Th细胞比例失衡，特别在活动期多出现Th、Tc细胞漂移现象[15-16]。T淋巴细胞平衡是保证二者间相互协同作用、发挥正常的免疫功能、维持机体内环境稳态所必需的。T淋巴细胞由CD4+T细胞和CD8+T细胞两个亚群组成，在骨髓的淋巴干细胞和胸腺中分化、发育成熟后，通过血液及淋巴循环迁往全身的免疫器官和组织中，二者释放大量细胞因子和淋巴因子，发挥直接杀伤靶细胞和免疫功能。根据分泌的细胞因子和介导的免疫功能不同，CD4+细胞分为Th1、Th2两个细胞亚群[17]。CD8+T细胞即Tc细胞，分为Tc1和Tc2两个细胞亚群，为细胞毒性T细胞，Tc细胞能直接参与攻击带异抗原的肿瘤细胞、病毒感染细胞和异体细胞[18]。Th1细胞主要合成IFN-γ、IL-2，Th2细胞主要合成IL-4和IL-10，前者参与迟发型超敏反应，后者参与速发型超敏反应[19]。由此可见，CD4+T细胞和CD8+T细胞与自身免疫反应和感染性疾病密切相关，CD4+T细胞和CD8+T细胞处于相对平衡状态，一旦平衡关系被打破，出现Tc、Th失衡(即Tc1/Tc2及Th1/Th2发生漂移)，CD4+T细胞和CD8+T细胞产生的淋巴因子或细胞因子即会产生特异性自身抗体，与自身抗原结合形成免疫复合物，从而发生自身免疫性疾病[20]。因此，阻止或抑制这种细胞漂移现象可能防止免疫功能紊乱，治疗这种自身免疫性疾病。自皮质类固醇冲击治疗系统性红斑狼疮至今，业已证实皮质类固醇虽然治疗作用显著，但其不良反应也日渐凸显，且新的药物及方法又没有突破性进展，为降低皮质类固醇冲击依赖，减少用量及停药后反复或复发，优化当前治疗方案、研究新药或发掘老药药效以减少皮质类固醇治疗引起的免疫功能下降具有重要的现实意义[21]。

表2 治疗不同阶段IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10含量变化比较(n=6，pg/ml)

注：与模型组比较，*P<0.05；与治疗前比较，#P<0.05；与0.25 mg/(kg·d)组比较，△P<0.05；与0.5 mg/(kg·d)组比较，▽P<0.05

表3 治疗前和治疗1个月、3个月时Th淋巴细胞亚群分类及比值比较(n=6，%)

注：与模型组比较，*P<0.05；与治疗前比较，#P<0.05；与0.25 mg/(kg·d)组比较，△P<0.05；与0.5 mg/(kg·d)组比较，▽P<0.05

雷公藤多苷片是从中药雷公藤中提取的生物碱，具有祛风解毒、除湿消肿、舒筋活络、抗炎及抑制细胞免疫和体液免疫等作用，临床已用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征、麻风病和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病[22-23]。目前雷公藤多苷片治疗系统性红斑狼疮的机制分析，多借鉴于风湿、类风湿、肾炎等的机制，而对系统性红斑狼疮的外周血Tc、Th细胞漂移现象的影响机制缺乏系统研究。Pristane为一类可引起各类细胞因子异常分泌并导致细胞膜非特异性炎症反应的异抗原，肌肉或腹腔注射吸收后，可诱导多种细胞质抗原和自身核抗原形成，是目前公认的诱导系统性红斑狼疮的异抗原[24]。本实验采用雷公藤多苷灌服的方法，观察其对由Pristane诱导的BALB/c裸鼠系统性红斑狼疮模型外周血Tc与Th细胞漂移的影响，分析雷公藤多苷调控与系统性红斑狼疮发病机制密切相关的Tc与Th细胞漂移过程，为临床治疗系统性红斑狼疮提供理论和实验依据。

有研究表明，IFN-γ、IL-2可能促进系统性红斑狼疮疾病的发展及组织器官损伤，而Th2细胞会减弱这一作用[25]。雷公藤多苷可能通过抑制Tc1细胞活化并促进Th2细胞活化，而发挥免疫调节作用。一般在系统性红斑狼疮活动期，Tc1细胞百分比升高、Tc2细胞百分比降低，且在系统性红斑狼疮发病时，出现CD4+下降、CD8+升高的现象，这在模型组中得以证实，提示Tc1/Tc2、Th1/Th2比例失衡是系统性红斑狼疮自身免疫损伤恶性循环及加重的重要机制。而改变或抑制T细胞漂移可能阻断免疫应答并降低免疫损伤。本研究结果发现，0.25 mg/(kg·d)组Tc2和Th2细胞百分比、IL-4和IL-10含量较治疗前、模型组同期和治疗1个月时明显升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量降低(P<0.05)。0.5 mg/(kg·d)组和1 mg/(kg·d)组Tc2和Th2细胞百分比、IL-4和IL-10含量在治疗1个月和3个月时较治疗前和模型组同期明显升高，而Tc1和Th1百分比、Th1/Th2及Tc1/Tc2比值、IFN-γ和IL-2含量明显降低，且0.5 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组同期比较差异有统计学意义，1 mg/(kg·d)组与0.25 mg/(kg·d)组和0.5 mg/(kg·d)组同期比较差异均有统计学意义。

综上所述，T细胞漂移影响Pristane诱发性红斑狼疮病理进程，雷公藤多苷通过纠正Tc1/Tc2、Th1/Th2失衡，调节Th1和Th2分泌的细胞因子水平而影响免疫应答来治疗红斑狼疮，且这种作用具有剂量依赖性。