丹参酮ⅡA对急性心肌梗死大鼠心脏功能和心肌线粒体自噬的影响①

王佳南 林建安 杜苗苗

(福建医科大学附属泉州第一医院，泉州362000)

急性心肌梗死(Acute myocardial infraction,AMI)是由冠状动脉持续缺血缺氧引起的心肌细胞坏死，可导致心力衰竭、恶性心律失常甚至猝死，严重威胁人类的健康[1]。研究表明，在缺血早期及时恢复血流供应能有效减轻心肌组织的损伤，降低急性心肌梗死患者死亡率[2]。但目前的药物和方法仅能影响急性心肌梗死患者中后期的预后[3]。自噬是降解长寿蛋白和受损细胞器的重要过程。研究发现，线粒体自噬在多类心血管疾病发展过程中也发挥了重要作用，并且在心脏疾病的不同时期和损伤的不同阶段发挥着不同的作用[5]。促进自噬能促进心肌梗死小鼠心肌功能的恢复，但自噬小体的过度堆积也可进一步加重心肌组织的损伤[5,6]。近年来研究表明[7,8]，中药在治疗缺血性心脏病方面具有较好的疗效。丹参是我国传统中药，其提取物丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSⅡA)能通过调控PI3K信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，提示TSⅡA具有明显的心脏保护作用[9]。但TSⅡA是否能通过调控线粒体自噬影响MI大鼠心脏功能的恢复还未见报道。本文采用冠状动脉结扎的方法复制大鼠AMI模型，以探究TSⅡA对AMI大鼠心肌功能的作用及与线粒体自噬的关系。

1 材料与方法

1.1主要试剂 清洁级SD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心。HE染色液和RIPA裂解液购自北京索莱宝生物公司。Tunel细胞凋亡试剂盒购自瑞士Roche公司。BCA试剂盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)试剂盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)试剂盒购自碧云天生物科技公司。肌红蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB,CK-MB)、肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponin,cTnⅠ)、Beclin1、P62和LC3一抗购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及模型复制 将60只体重在220～280 g的清洁级SD雄性大鼠随机分为对照(Ctrl)组、MI组、TSⅡA(20)组、TSⅡA(50)组和TSⅡA(100)组，每组12只。将所有大鼠适应性喂养3 d 后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，连接呼吸机，呼吸频率在50～60次/s范围内。随后分离左侧冠状动脉，除Ctrl组外，用手术缝合线结扎左侧冠状动脉前降支，肉眼观察结扎部位缺血组织苍白或发绀，搏动减弱且心电图Ⅱ导联出现ST段持续抬高视为造模成功。Ctrl组大鼠除不结扎前降支外，其他操作同上。模型复制成功后，TSⅡA(20)组、TSⅡA(50)组和TSⅡA(100)组大鼠每天分别腹腔注射20 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的TSⅡA，Ctrl组和MI组大鼠每天腹腔注射等量生理盐水，连续注射3周。于处死前检测各组大鼠平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)、心率(Heart rate,HR)和左室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)，并分离心肌组织，计算心肌梗死面积。

1.2.2组织样品准备 将大鼠用10%水合氯醛麻醉后，用注射器于心脏取血，室温静置1 h后以3 500 r/min的转速将全血离心15 min，取上清液分装后储存于-20℃备用。随后立即取下心肌组织，将左心室平均分为3份。取一份用4%的多聚甲醛室温固定4 h，以乙醇进行梯度脱水后，采用二甲苯透明，随后用石蜡包埋，制作5 μm的石蜡切片，保存于-20℃备用。

1.2.3线粒体提取 根据文献[10]的报道方法，取下心脏组织后将组织剪碎并匀浆，采用差速离心法提取心脏组织线粒体。

1.2.4HE染色检测心肌组织 取各组石蜡切片进行脱蜡处理，随后用浓度从高到低的乙醇对切片进行水化后，蒸馏水冲洗10 s，将切片放入苏木精染色液中室温染色20 min，再用自来水冲洗切片至切片变蓝。将切片放入1%的盐酸乙醇溶液中，10 s后取出用自来水冲洗。用乙醇溶液对切片进行梯度脱水，脱水后将切片放入伊红染色液中染色2 min，再次用高浓度乙醇进行脱水，并用二甲苯透明，最后采用中性树胶封片，于生物显微镜下观察组织损伤情况。

1.2.5Tunel染色检测细胞凋亡 将石蜡切片用二甲苯和乙醇进行脱蜡和水化处理后，根据Tunel试剂盒说明书对切片进行染色，于显微镜下观察凋亡小体的形成情况并统计。

1.2.6试剂盒检测SOD、MDA和GSH浓度 取血清于4℃溶解后置于室温复温30 min，根据SOD、MDA和GSH试剂盒说明书检测血清中SOD、MDA和GSH的浓度。

1.2.7Western blot检测蛋白表达 取用裂解液提取线粒体或组织总蛋白，用BCA蛋白定量测定试剂盒对蛋白质进行定量分析。将蛋白浓度调平后，每组取40 μg 总蛋白用10%SDS-PAGE分离蛋白质，用半干转膜仪将蛋白质转移到PVDF膜上，用缓冲液清洗后，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，随后加入适宜浓度一抗，4℃孵育过夜，第二天洗去未结合一抗，滴加二抗室温反应1 h，充分漂洗后加入化学反光显色液曝光显影。

2 结果

2.1TSⅡA对MI大鼠心肌功能的影响 如图1所示，大鼠心肌梗死3周后，MI组大鼠MAP、HR和LVSP均明显低于Ctrl组(P<0.01)；TSⅡA(20、50、100)组大鼠MAP、HR和LVSP与MI组比较均明显升高(P<0.05,P<0.01，图1)。此外，MI组大鼠心肌组织Mb、CK-MB和cTn Ⅰ的表达水平均显著高于Ctrl组(P<0.05，P<0.01，图2)，TSⅡA(20、50、100)组大鼠Mb、CK-MB和cTn Ⅰ的蛋白表达水平与MI组比较均显著降低(P<0.05，P<0.01，图2)，并随浓度升高作用逐渐增强，表明TSⅡA能增强MI大鼠的心脏功能。

图1 TSⅡA对MI大鼠MAP、HR和LVSP的影响Fig.1 Effects of TSⅡA on MAP,HR and LVSP of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

2.2TSⅡA对MI大鼠心肌损伤的影响 HE染色结果表明，正常组大鼠心肌纤维结构排列整齐，无水肿及充血；脑梗死后，MI组大鼠心肌纤维排列紊乱，并出现带状空泡化改变、细胞核固缩并伴有大量炎性物质渗出(图3)，同时心肌梗死面积显著大于Ctrl组(P<0.01，图4)；TSⅡA(20、50、100)组大鼠心肌组织病理损伤情况较MI组比较有所减轻，并随浓度升高，损伤程度逐渐减轻(图3)，同时心肌梗死面积也显著低于MI组(P<0.05，P<0.01，图4)；此外，MI还能显著升高心肌细胞凋亡率(P<0.01，图5)，TSⅡA(20、50、100)能显著降低MI模型大鼠心肌组织的细胞凋亡率(P<0.05，P<0.01，图4)，表明TSⅡA 能减轻MI大鼠的心肌组织损伤，并具有量效关系。

图2 TSⅡA对MI大鼠心肌组织Mb、CK-MB和cTnⅠ表达的影响Fig.2 Effect of TSⅡA on the expressions of Mb,CK-MB and cTnⅠNote: The protein levels of Mb,CK-MB and cTnⅠ were determined by western blot.GAPDH was used as loading control.**.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

图3 TSⅡA对MI大鼠心肌病理损伤的影响Fig.3 Effect of TSⅡA on myocardial lesion of MI ratsNote: HE staining was performed for phathology injury of rats.

图4 TSⅡA对MI大鼠心肌梗死面积的影响Fig.4 Effect of TSⅡA on myocardial infraction size of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

图5 TSⅡA对MI大鼠心肌细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of TSⅡA on myocardial cell apoptosis of MI ratsNote: Cell apoptosis was determined by Tunel assay.**.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

2.3TSⅡA对MI大鼠心肌组织氧化应激的影响 与Ctrl组比较，MI组大鼠血清SOD和GSH的浓度明显降低，MDA浓度明显升高(P<0.01，图6)；与MI组比较，TSⅡA(20、50、100)组模型大鼠血清SOD和GSH含量显著升高，MDA含量显著降低，并具有剂量依赖性(P<0.05，P<0.01，图6)，表明TSⅡA 能抑制MI大鼠心肌组织氧化应激。

2.4TSⅡA对MI大鼠线粒体自噬的影响 Western blot实验结果表明，心肌缺血能显著升高大鼠心肌组织Beclin 1的表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，降低P62的蛋白表达水平(P<0.01，图7)；TSⅡA(20、50、100)能显著降低缺血诱导的MI模型大鼠心肌组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin 1的蛋白表达水平，诱导P62表达(P<0.01，图7)，并随浓度的升高，对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1和P62表达的调控作用逐渐增强，表明TSⅡA能抑制MI大鼠线粒体自噬。

图6 TSⅡA对MI大鼠血清SOD、MDA和GSH浓度的影响Fig.6 Effect of TSⅡA on concentrations of SOD,MDA and GSH of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001 versus MI model group.

图7 TSⅡA对MI大鼠心肌组织LC3、Beclin 1和P62表达的影响Fig.7 The effect of TSⅡA on expressions of LC3,Beclin 1 and P62 in myocardial tissues of MI ratsNote: GAPDH was used as loading control.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus MI model group.

3 讨论

冠状动脉阻塞是导致MI的主要原因。血流供应的减少可导致心肌代谢紊乱，长时间的缺血缺氧可导致心肌功能的紊乱和心肌不可逆坏死，最终导致心衰。研究表明，心肌梗死面积与心脏功能呈正相关[11]。目前，大量临床前研究发现多种药物能缩小动物心肌梗死面积，但大多都在临床试验时以失败告终[9]。因此，急需寻找治疗MI的新药物。TSⅡA 是我国传统中药丹参的有效活性成分之一，主要提取自丹参的干燥根及根茎部位，丹参在我国已有上千年的用药历史，常被应用于心血管疾病的治疗[12]。现代研究也表明TSⅡA具有明显的心肌保护作用，能够对抗动脉粥样硬化、心肌缺血和心肌缺血再灌注损伤[11,13,14]。提示TSⅡA可能具有治疗临床MI的潜力。也有研究表明，TSⅡA能够通过抑制心肌组织的炎症反映增强MI大鼠的心脏功能[15]。本文研究结果表明，TSⅡA能显著升高MI模型大鼠的MAP、HR和LVSP，同时还能促进心肌组织Mb、CK-MB和cTnⅠ的表达，表明TSⅡA能增强MI模型大鼠的心脏功能。此外，结扎冠状动脉可导致大鼠心肌组织水肿、细胞排列紊乱及炎性细胞的浸润，TSⅡA能显著减轻MI模型大鼠心肌组织的损伤情况，缩小MI大鼠的心肌梗死面积，并随浓度升高作用逐渐增强，TSⅡA还能抑制缺血诱导的心肌细胞凋亡，心肌细胞凋亡是导致心肌梗死的主要原因，提示TSⅡA在增强MI模型大鼠心脏功能的同时还能减轻缺血导致的心肌损伤，进一步表明TSⅡA具有较强的心血管保护作用。

氧化应激是导致缺血后心脏功能紊乱及心肌细胞死亡的主要机制之一。缺血后大量氧自由基的产生诱导心肌细胞凋亡，也可直接作用于心肌细胞膜内的脂肪酸，诱导细胞膜脂质过氧化反应，改变细胞膜的渗透性[16]。脂质过氧化物的积累可直接反映心肌的损伤程度。MDA是主要的脂质过氧化产物之一，MDA的过度积累又可进一步诱导氧化自由基的产生，从而抑制抗氧化系统的激活，使损伤进一步加重[17]。SOD是细胞抵抗氧化损伤的首要防线，能在清除活性氧化自由基的同时抑制羟自由基的产生[16]。大量研究表明，TSⅡA具有明确的抗氧化应激活性，可减轻间歇性缺氧诱导的心肌细胞损伤[18]。本文研究结果表明，MI模型大鼠血清SOD和抗氧化剂GSH浓度明显低于健康大鼠，MDA浓度显著升高，提示缺血缺氧可能诱导了心肌组织氧化应激。TSⅡA能显著降低MI大鼠血清中MDA的浓度，升高SOD和GSH浓度，表明TSⅡA能抑制心肌组织氧化应激。

线粒体是细胞的“能量工厂”，在多种病理情况下都发挥了重要作用[19]。研究表明，在缺血、缺氧及缺乏营养物质等应激条件下，氧化应激和细胞内活性氧的积累可诱导线粒体自噬反应，清除受损线粒体[20]。线粒体自噬与心肌缺血后心肌损伤密切相关[4]。缺血缺氧可导致线粒体功能紊乱，从而导致活性氧及促凋亡蛋白的表达，进一步加重损伤，因此，早期通过自噬及时清除受损线粒体有利于减轻细胞损伤[21]。但在受损后期，过度自噬体则可导致心肌细胞的死亡[22]。研究表明，TSⅡA能提供调控自噬减轻缺血引起的神经细胞损伤，提示TSⅡA具有调控缺血后自噬的活性[23]。本文采用冠脉结扎法复制了大鼠MI模型，并探究了TSⅡA对MI 3周后大鼠线粒体自噬的影响。发现TSⅡA能显著降低MI模型大鼠线粒体Beclin 1的表达水平和LC3Ⅱ/LCⅠ的比值，促进线粒体P62的表达。其中，Beclin 1在自噬的起始阶段发挥着重要作用，LC3则主要参与自噬小体的形成，能诱导自噬相关蛋白的募集，P62主要参与溶酶体的降解表达水平与自噬呈负相关[24,25]。实验结果表明，TSⅡA能抑制MI大鼠心肌线粒体自噬的发生。MI后3周已属于MI的后期，结合前述文献报道表明TSⅡA增强心脏功能、减轻心肌损伤的作用可能与抑制线粒体自噬有关。

综上所述，TSⅡA能升高MI模型大鼠MAP、HR和LVSP，抑制心肌组织Mb、CK-MB和cTnⅠ表达；同时，TSⅡA还能减轻模型大鼠心肌组织病理损伤，抑制心肌细胞凋亡、减少心肌梗死面积；此外，TSⅡA还能显著抑制MDA分泌，升高血清SOD和GSH浓度，下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin 1的蛋白表达水平，促进线粒体P62的表达，表明TSⅡA能增强MI大鼠心脏功能、减轻心肌组织损伤和抑制心肌组织氧化应激，其作用机制可能与抑制线粒体自噬有关。本文首次探究了TSⅡA对MI后期的心肌保护作用与线粒体自噬的关系，可能为TSⅡA应用于MI后期的治疗提供了新的实验数据支撑。