肉制品中亚硝胺形成机制及植物源提取物对其阻断效果的研究进展

2019-03-08邓思杨董依迪张岱玉夏秀芳

食品科学 2019年3期

邓思杨，石硕，董依迪，张岱玉，刘骞，王浩*，夏秀芳*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

亚硝胺是由亚硝化试剂与胺类化合物（仲胺或酰胺）反应生成的一类亚硝基化合物[1]。人体内的亚硝胺主要通过两种途径形成：外源性摄入和内源性生成。前者通常来源于加工食品本身存在的亚硝胺及其前体物质，加工食品主要包括肉制品、酒精饮料、蘑菇和一些奶酪，其中肉制品（香肠、烟熏羊肉、腌肉、火腿和培根）是最主要的来源[2-4]；后者来源于亚硝胺在体内的合成，在口腔或胃内的酸性条件下发生亚硝化反应，导致内源性亚硝胺的形成。亚硝胺可分为挥发性亚硝胺和非挥发性亚硝胺，其中挥发性亚硝胺在肉制品中所占比例较大，它作为一种代表性的有毒有害物质，对人类具有致癌性和致突变性，可在人体内诱发一系列疾病，如胃癌、结肠癌、直肠癌和食管癌等[5-6]。一些流行病学及动物实验已经证实，从植物中提取的某些天然成分（如抗坏血酸、还原糖、茶多酚和有机硫化物等）能够起到阻断亚硝胺合成或清除亚硝酸盐的作用，从而起到预防癌症发生的效果[1]。

植物源天然提取物具有天然健康、来源广泛、安全无毒、热稳定性好等优点[1]。用植物源天然提取物全部或部分替代亚硝酸盐（或硝酸盐）不仅能够起到防腐保鲜的作用，同时还能够提高加工肉制品的安全性，延长肉制品货架期[7]。另外，植物源天然提取物生产工艺的不断改进也使得它在肉制品中的应用越来越广泛。作为纯天然、高效的亚硝胺抑制剂，植物源天然提取物已经越来越多地应用于肉制品生产中，来替代对人体健康造成潜在威胁的合成防腐剂[8]。

本文综述了肉制品中亚硝胺的形成过程及其影响因素、亚硝胺对人体的潜在危害，将着重论述植物源天然提取物对亚硝酸盐的清除能力以及对亚硝胺形成的阻断作用。为控制腌肉制品实际生产过程中亚硝胺的形成、阻断亚硝胺的生成路径提供一定的参考。

1 腌肉制品中亚硝胺的形成

1.1 亚硝胺的产生及形成机理

亚硝酸盐是典型的肉制品腌制剂，具有发色、抗氧化[9]和抑制肉毒梭菌生长及产生毒素的作用。但在肉制品加工过程中硝酸盐使用不当可能会产生有害物质亚硝胺。添加到肉制品中的硝酸盐在细菌的作用下可被还原成亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐生成不稳定的HNO2，随后快速分解得到亚硝基化反应重要的前体物质N2O3（亚硝酐）。Mirvish[10]、Sannino[11]等研究发现加工肉制品中的亚硝胺主要来源于添加的亚硝酸盐或硝酸盐。N2O3作为亚硝化试剂与次级胺反应生成亚硝胺类物质[12]。亚硝胺类物质的形成途径如图1所示。此外，亚硝胺本身也可作为亚硝化试剂与一些次级胺反应生成其他亚硝胺类物质。

图1 亚硝胺类物质的形成途径Fig.1 Proposed formation mechanism of N-nitrosamines

1.2 亚硝胺形成的影响因素

加工肉制品中亚硝胺的形成会受到诸多因素的影响，包括原料肉种类、肉制品加工条件（加热时间、温度和方式）、pH值、添加剂种类（包括催化剂和抑制剂）以及微生物作用等[13-14]。

由于食物链富集原则，体内摄入亚硝酸盐的量越高，转化成亚硝胺的量也就越大[15]，因此用红肉（猪、牛、羊肉）、老龄动物或人工饲养动物生产加工的肉制品中亚硝胺含量相对较高。

加工条件对亚硝胺生成量有显著影响：肉制品中亚硝胺的含量随着加热温度的升高和加热时间的延长而增加，特别是不饱和脂肪酸含量高的肉制品更加明显；对于加热方式，与微波加热和蒸煮处理相比，煎炸工艺生成的亚硝胺更多，这可能与微波加热和蒸煮处理产生的温度比煎炸低有关[13]。Li Ling等[16]将香肠分别进行蒸煮、煎炸和微波处理后，发现其亚硝胺总量在4.95～6.92 µg/kg之间，并且煎炸处理组的亚硝胺含量明显高于蒸煮和微波处理组。

pH值是影响亚硝化反应的重要因素之一，HNO2自身不稳定，在pH值较低的环境下能更快解离出NO＋，促进亚硝化反应的进行。肉制品中添加剂的使用也会对亚硝胺的形成造成潜在影响，主要包括：亚硝酸钠（硝酸钠）添加量、食盐添加量、亚硝胺生成催化剂和抑制剂等。大量研究表明，亚硝酸盐的添加量和残留量与亚硝胺生成量之间存在一定的正相关关系[16-17]，胺类化合物的亚硝化反应速率与亚硝酸盐浓度的平方成正比[8]。

目前已发现食品中多种天然或合成的组分对亚硝胺含量有重要的影响。维生素（如VC、VE）、酚类化合物（如茶多酚）以及其他天然提纯化合物（如大蒜素）都可作为亚硝胺抑制剂[18]，对亚硝化反应具有阻断作用。而黑胡椒、辣椒等的添加反而起到促进亚硝胺生成的作用[2]，因此加工过程中某些香辛料的添加或许有潜力成为亚硝胺形成的催化剂。

此外，微生物在亚硝化反应中的作用也不容忽视。具有亚硝胺合成能力的细菌能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐；将蛋白质降解成胺和氨基酸；产生可以促进亚硝化反应的酶；以及创造亚硝化反应所需的pH值条件[19]。

2 亚硝胺的危害

2.1 亚硝胺的致癌性及致癌机理

亚硝基化合物易对人体产生致癌作用，属于强致癌化合物，专家认为亚硝胺可能在肺、脑、肝、肾、膀胱、胃、食管和鼻窦等不同器官和组织中都会诱发癌症。目前，经过大量的动物实验后发现，约300 种亚硝胺可以在实验动物体内诱导癌症生成，这类能诱发癌症的代表性化合物至少存在于40 种不同的动物物种中，其中就包括高等的灵长类动物。

亚硝胺本身无致癌性和致突变性，需要在体内经过生物转化才能生成致癌物质。生物转化的机制为：亚硝胺化合物中与氨氮相连的α-碳上的氢被氧化，发生羟基化，所得的羟烷基部分作为醛而被除去，由此形成了不稳定的初级亚硝胺，不稳定的亚硝胺最终分解异构为烷基偶氮羟基化合物，此化合物作为致癌剂诱导体内癌症的产生[20-22]。亚硝胺在烷基化过程中产生的一些活性中间代谢产物也可作为烷化剂，与DNA或RNA反应，经甲基化损伤的DNA、RNA被错误修复，导致鸟嘌呤-胞嘧啶、腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对被修饰转化，从而引起肿瘤[5]。

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在诸多研究中被检出的挥发性亚硝胺是强烈的人体致癌物，如亚硝基二甲基胺（nitrosodimethylamine，NDMA）和亚硝基吡咯烷（nitrosopyrrolidine，NPYR）；而非挥发性亚硝胺为弱致癌物，亚硝基肌氨酸是典型的非挥发性亚硝胺，还有一部分可能为非致癌物质，如亚硝基脯氨酸（nitrosoproline，NPRO）、亚硝基羟脯氨酸（nitrosohydroxyproline，NHPRO）、亚硝基噻唑烷-4-羧酸（nitroso-thiazolidine-4-carboxylic acid，NTCA）和亚硝基-2-甲基-噻唑烷-4-羧酸（nitroso-2-methyl-thiazolidine-4-carboxylic acid，NMTCA）[23]。急性（短期）接触NDMA可能会损害人体肝脏，症状包括恶心、呕吐、头痛和不适。人类慢性（长期）接触NDMA可能会造成肝脏损伤和血小板数量降低。然而疑似无致癌性的非挥发性亚硝胺NPRO、NHPRO、NTCA和NMTCA，具体有无致癌性还需通过实际的毒理学体内实验进行验证。只要无法确定这类亚硝胺无致癌性，就应尽可能采取措施抑制亚硝胺的生成。

2.2 亚硝胺的致突变性

除致癌性外，亚硝胺还具有致突变性。亚硝胺本身不是直接致突变物，需要经过哺乳动物微粒体混合功能氧化酶系统代谢，被肝酶（如细胞色素P450）激活后才具有致突变性。详细的亚硝胺致突变性形成机理的相关研究较少，有待进一步探究。研究表明，亚硝胺的致癌性强弱和致突变性强弱之间无明显相关性[24]。理论上，在热处理过程中或在大肠内微生物的作用下，这些亚硝胺能脱羧形成相应的致突变物。

3 植物源天然提取物对亚硝胺合成的抑制作用

植物源天然提取物中含有丰富的维生素、酚类以及其他天然活性化合物，是有效的天然抗菌剂和抗氧化剂。作为抗菌剂，植物源天然提取物能够破坏细菌细胞膜，造成细胞成分泄漏，从而使细胞失活，起到杀菌作用[25]。在酸性环境下，维生素和酚类化合物又可作为亚硝胺阻断剂，在保证加工肉制品贮藏稳定性的前提下，将亚硝酸还原成NO，抑制亚硝化反应前体物N2O3的产生，制约亚硝化反应的进行。此外，一些植物源天然提取物可作为亚硝酸盐替代物，直接清除亚硝酸盐，避免了亚硝胺的形成。以下分别叙述天然果蔬、天然香辛料、中草药以及其他植物活性提取物对亚硝酸盐的清除及对亚硝胺形成的抑制作用。

3.1 天然果蔬及其提取物对亚硝胺形成的抑制作用

果蔬提取物对亚硝胺发挥阻断作用的机理是将亚硝化试剂还原成无毒的N2、NO等。果蔬提取物富含还原性成分和抗氧化物质，如VC、VE、酚类化合物、黄酮类化合物、半胱氨酸等，能够阻断亚硝胺的合成并抑制其毒性。水果和蔬菜是天然的抗菌剂，可以抑制肉制品中一些菌群的生长繁殖，利用水果和蔬菜提取物全部或部分替代亚硝酸盐，降低了形成亚硝胺的可能性。

3.1.1 蔬菜及其提取物对亚硝胺形成的抑制作用

蔬菜（如新鲜的芹菜、菠菜、韭菜）是一种自身含有天然硝酸盐的植物性食品[26]，是人体摄取硝酸盐的主要来源。在肉制品中添加天然蔬菜及其提取物，在替代亚硝酸盐的同时能够改善肉制品加工过程中的异味，提高产品风味。

芹菜汁和芹菜粉约含质量分数3%的硝酸盐[27]，还含有少量的天然色素，味道温和，添加到肉类产品中不会破坏肉制品本身的味道，在发挥亚硝酸盐抑菌作用的同时还保留了肉制品的特性。向灌肠中加入发酵芹菜粉，发现其在清除亚硝酸盐和发挥抗氧化性方面表现良好，其中将38 ℃下发酵24 h的芹菜粉添加到灌肠中，对亚硝胺的抑制效果较佳。Gabaza等[28]发现干燥菠菜可用作硝酸盐替代物，与未添加菠菜汁的样品相比，添加发酵菠菜汁（50 g/L）的猪肉样品中亚硝酸盐残留量更低。蔬菜中的天然硝酸盐，在发酵过程中可在硝酸盐还原菌的作用下转化为亚硝酸盐，从而替代化学合成的亚硝酸盐而起到发色、抑菌、抗氧化和提高风味的综合作用[29]。用鲜榨蔬菜汁（黄瓜、水萝卜、西红柿、白萝卜、西葫芦）进行亚硝酸盐的清除，蔬菜汁的添加浓度与清除亚硝酸盐的能力成正比，其中黄瓜汁对亚硝胺的抑制效果最好。Choksi等[30]发现番茄加工后副产中含有大量生物活性物质，如类胡萝卜素（可作为天然食物着色剂）、番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素等。番茄中的生物活性物质与亚硝酸盐复配可将硝酸盐转化为NO，从而降低腌肉制品中亚硝酸盐的残留。这些蔬菜汁清除亚硝酸盐的能力可能与其含有的VC、黄酮类化合物、VE、不饱和脂肪酸、花青素、番茄红素等成分有关。

水果是植物源天然抗氧化剂的来源之一，苹果、蓝莓、柠檬、葡萄、蔓越莓和柑橘等都是含量丰富、来源广泛的主要原料[31]。蔓越莓的抗氧化性和抗菌性与有机酸（柠檬酸、奎尼酸和苹果酸）、花青素、黄酮醇苷和原花色素的含量密切相关，这些类黄酮化合物是抑制肉制品中亚硝胺形成的重要组分。Qiu Xujian等[32]发现蔓越莓粉在作为亚硝酸盐替代物抑制亚硝胺产生的同时，还可抑制腌肉中单增李斯特菌的生长。柠檬、葡萄籽提取物与蔓越莓粉末混合添加后抗菌效力明显提高[33]。使用15 种不同品种的蓝莓果实提取物处理蒸煮火腿，发现添加了蓝莓果实提取物的肉制品与未添加的对照组相比，亚硝酸盐质量分数下降6.30%～38.1%，亚硝胺质量分数下降53.6%～71.5%，抑制效果显著。柑橘类水果提取物富含膳食纤维、抗氧化纤维、有机酸和多酚等生物活性化合物，可添加到肉制品中降低亚硝酸盐残留量。Fernández-Ginés等[34]发现质量分数2%橙色膳食纤维和质量分数0.02%牛至精油混合物可降低Bologna香肠69.6%的亚硝酸盐残留量；与未添加橙色膳食纤维的腌肉制品相比，其亚硝酸盐残留量降低，肉红度值升高；此外还发现柠檬对熟肉和干腌肉制品中的亚硝酸盐也具有同样的清除效果。

天然水果及其提取物之所以能够对亚硝胺起到抑制作用，是因为水果中含有较高浓度的类黄酮和酚类化合物。不同浆果的酚类化合物种类和含量差别很大。花色苷是蓝莓、蔓越莓和苦莓中阻断亚硝胺类物质产生的主要成分；蓝莓中的绿原酸、蔓越莓和越橘中的槲皮素苷、苦莓中的咖啡酸及其衍生物在肉制品生产加工中发挥着抑制亚硝胺类物质产生的作用[35]。

3.2 天然香辛料及其提取物对亚硝胺形成的抑制作用

香辛料提取物阻断亚硝胺的机理也是通过与亚硝酸盐发生氧化还原反应达到阻断效果。天然香辛料中富含不饱和脂肪酸、硫化物、酚类化合物和黄酮类化合物等抗氧化物质。天然香辛料提取物中的酚类化合物可分为以下4 种：酚酸（如没食子酸、咖啡酸和迷迭香酸）、酚二萜（如鼠尾草酸和鼠尾草酚）、类黄酮（如儿茶素、槲皮素、大蒜素）以及精油（如丁香酚、百里酚、薄荷醇）[31]。

大蒜和洋葱是实际生活中应用最广泛的香辛料，对亚硝胺的抑制效果显著。洋葱中含有大量的硫化物和类黄酮。李妍姣[36]发现洋葱中黄酮（以乙醇为提取溶剂）质量浓度达到0.08 mg/mL时，对亚硝酸盐清除率及亚硝胺生成的最大阻断率均达到最大值，分别为83.7%、94.4%。大蒜中生物活性成分为砜类化合物（如S-烯基半胱氨酸亚砜）和其他硫组分（如二烯丙基二硫化物和二烯丙基三硫化物）。辛国华等[37]发现一定浓度的大蒜素对甲基苄基亚硝胺的形成具有明显的抑制作用。Sun等[18]在模拟唾液和胃液条件下，发现大蒜汁对NDMA的阻断效果明显，并具有清除亚硝酸盐的作用。

大多数香料提取物含有醇类和酚类化合物，如丁香酚、异丁香酚、右旋冰片、香茅醇、薄荷醇、肉桂酸醛和迷迭香酸等。香辛料及其提取物的使用可以降低亚硝胺的含量，从而减少熟制腌肉中致癌物质的生成。张健斌[38]发现添加体积分数0.2%的八角精油时对腊肠中NDMA的抑制率最高，与不加抑制剂的腊肠相比NDMA含量降低了89.0%，但是八角精油对亚硝酸钠的清除作用较弱；在此条件下再加入体积分数0.2%的丁香精油，对该组腊肠中NDMA的抑制效果更佳。

然而，并非所有的香辛料都对亚硝胺具有抑制作用，Herrmann等[2]向熟制香肠中加入不同量的黑胡椒粉，随着黑胡椒粉添加量的增大，NTCA和NMTCA的含量也逐渐增大，说明黑胡椒的添加促进了一些亚硝胺的产生。这与Ahn等[39]发现香肠中的黑胡椒和辣椒两种香料可与NaNO2反应生成NPYR和亚硝基哌啶的结果一致，因此某些香料与NaNO2同时作为腌制剂时会产生亚硝胺。张甜等[40]将大葱、大蒜、生姜和洋葱4 种香辛料的冻干粉加入到亚硝化反应体系中，在4 ℃或25 ℃时，大蒜及生姜冻干粉对NDMA表现为抑制作用，但在80 ℃时大蒜粉反而促进NDMA的生成；这说明选用香辛料作为肉制品亚硝胺阻断剂时，要同时考虑所用香辛料种类和加工条件，以及它们之间的相互作用。

3.3 中草药及其提取物对亚硝胺形成的抑制作用

我国中草药资源较为丰富，随着科学技术的进步，其使用范围越来越广。由于中草药具有良好的保健功能和抑菌效果，现已被应用于肉制品防腐、抑制亚硝胺合成的研究中。中草药中黄酮类物质极为丰富，故中草药及其提取物具有清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成的作用。

王琪等[41]在体外模拟人体胃液的条件下，研究了11 种常见的富含黄酮类物质的中草药（金银花、山楂、杜仲、黄芩、鱼腥草、溪黄草、野菊花、银杏叶、忍冬藤、甘草、葛根）对NDMA合成的阻断能力，发现这11 种中草药对NDMA的抑制作用与黄酮含量成正比，其中金银花阻断率最高，达78.5%，溪黄草阻断率最低，仅为9.9%。郭春燕等[42]分别将鱼腥草、菊花、苍术、吴茱萸和麻黄5 种中草药添加到含有二甲胺和亚硝酸钠的模拟人体胃液中，观察其对亚硝胺的抑制效果，发现吴茱萸提取液对亚硝胺合成的阻断能力和对亚硝酸盐的清除能力最强。李粉玲等[43]在模拟人体胃液条件下，用超声辅助提取的金丝草多糖提取液进行亚硝酸钠清除实验，发现添加的提取液质量浓度为1.4 mg/mL时，对亚硝酸钠的清除率达到最大，为56.4%。目前中草药及其提取物在亚硝胺抑制方面的研究还处于起步阶段，中草药及其提取物对亚硝胺抑制机理的研究有待进一步深入。

3.4 其他植物提取物对亚硝胺形成的抑制作用

植物提取物中含有大量的黄酮类、酚酸类、黄酮醇类及花色苷等多酚类物质。植物来源的多酚具有多种生物学功能，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌活性等。植物提取物之所以能够清除亚硝酸盐、抑制亚硝胺的合成，是因为酚类化合物在酸性条件下易被NO2－氧化成醌类化合物，同时NO2－被还原成NO，从而阻断了亚硝化反应，抑制亚硝胺的生成。此外，植物提取物对防止肉制品中的脂质氧化、维持肉制品颜色稳定性具有积极作用。

有研究人员选用植物提取物作为天然无毒的防腐剂添加到肉制品中，发现其对肉制品中亚硝胺合成的抑制效果显著。Wang Yongli等[44]在中式干腌培根中分别添加绿茶多酚、葡萄籽提取物、α-生育酚、绿茶多酚和葡萄籽提取物的混合物，发现上述几种植物多酚对NDMA的合成均具有抑制作用，其中单独添加绿茶多酚对NDMA合成的抑制效果最佳，未添加茶多酚的对照组NDMA含量为0.51 µg/kg，而茶多酚处理组NDMA含量为0.25 µg/kg，且茶多酚处理组的亚硝胺含量明显下降。绿茶多酚能够阻断NDMA形成主要原因是其含有较高含量的儿茶素、单宁等。Li Ling等[17]将绿茶多酚、葡萄籽多酚和抗坏血酸加入到干腌香肠中，它们对亚硝胺的抑制作用由大到小依次为：抗坏血酸＞绿茶多酚＞葡萄籽多酚，抗坏血酸对干腌培根成熟28 d后的抑制效果尤其明显。王雅利[45]报道了7 mg/mL葡萄源膳食花色苷对NDMA的抑制率可达到70.0%，14 mg/mL葡萄源膳食花色苷对亚硝基二乙胺的阻断率为57.1%，对NPYR的阻断率为56.1%。葡萄源膳食花色苷属类黄酮多酚化合物，添加到食品中能有效抑制外源性和内源性亚硝胺的形成，能有效减少亚硝胺对人体的危害。黄晓冬等[46]发现相较于桐花树叶总黄酮提取物和桐花树叶醇提取物，桐花树叶多酚提取物对亚硝酸盐的清除率及对亚硝胺的阻断效率最大。8 mg/mL多酚提取物处理3 h，亚硝酸盐清除率达到100.0%；7 mg/mL多酚提取物处理3 h，对NDMA的阻断率可达82.2%。酚类化合物在酸性条件下易被NO2－氧化成醌类化合物，同时NO2－被还原成NO，从而阻断了亚硝化反应，抑制了亚硝胺的生成。3 种桐花树叶提取物对亚硝胺抑制效果最好的为桐花树叶多酚提取物，黄酮属于多酚，因此桐花树叶总黄酮提取物的抑制作用仅次于桐花树叶多酚提取物。

4 结语

亚硝酸盐是加工肉制品中应用最广泛的食品添加剂，但其在酸性环境下不太稳定，容易与次级胺发生亚硝化反应生成致癌性亚硝胺，它能在人体组织和器官中诱发癌症。清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺的合成是防癌的有效途径。国内外针对植物源天然提取物对肉制品中亚硝酸盐的清除能力，以及对亚硝化反应的抑制作用进行了研究。果蔬、香辛料、中草药及其他植物提取物中含有丰富的维生素、多酚、醇类及类黄酮等还原物质，对亚硝胺的抑制效果显著。随着消费者对肉类食品安全性要求的提高，植物源天然提取物的开发、在提高肉类食品安全性方面作用效果，以及作用机理可能会成为研究热点。