酵母抽提物在热反应中鲜味的变化及肽的鉴定

阿衣古丽g阿力木，宋焕禄*，刘 野，邹婷婷，张 雨，张松培

（北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048）

酵母抽提物（yeast extract，YE）既是强鲜味剂，又是风味增强剂。因此，在各类食品及食品原料的生产加工过程中添加YE后，应适当减少及调整原配方中其他食品添加剂（如肌苷酸（inosine acid，IMP）＋鸟苷酸（guanine nucleotide，GMP）、味精、水解植物蛋白液和水解动物蛋白）的用量。这些滋味活性物质赋予食品鲜味、苦味、甜味、酸味等基本味及近期发现的浓厚味。在起初的滋味研究中，因为没有找到鲜味的味觉受体，因此鲜味并没有被算作是基本味。2000年Chaudhari[1]和Nelson[2]等找到了鲜味的受体——谷氨酸（Glu）的G蛋白偶联受体（例如mGluR4和异源性T1R1＋3受体），这一发现具有里程碑式的作用。一般推测鲜味的代表物质是L-Glu和其他一些L型氨基酸，这些鲜味氨基酸反映了食品中另一个不可或缺的营养素——蛋白质的含量[3]。在YE中氨基酸、核苷酸、硫胺素、还原糖以及多肽类化合物也是滋味化合物，这些化合物在加热过程中发生美拉德反应。热反应产物中有大量的滋味活性物质。其中Festring等利用反相高效液相色谱（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）-串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）法测定YE中的4 种核苷酸，发现IMP、GMP对鲜味具有提升作用[4]。肽及美拉德反应产物因具有独特的滋味活性而被关注。

鲜味是最近被人们认可的一种基本味，随着对鲜味肽的深入探究，有学者对含有Glu残基的12 种二肽，如Glu-Asp、Glu-Ser、Glu-Thr和Glu-Glu等进行感官研究，发现在C-端疏水性较小的氨基酸的二肽具有肉汤鲜味。有研究报道，一些鲜味肽本身的鲜味可能不明显，但与谷氨酸单钠盐、GMP、IMP、食盐等共同存在时可以促进其产生鲜味或使鲜味变得更加强烈，称为鲜味增强肽[5-6]。Maehashi等[7]从鸡胸肉提取出6 种对鲜味提升具有明显效果的鲜味提升肽，其中Glu-Glu、Glu-Val两种肽本身也具有鲜味。Han Fuliang等[8]在黄酒中发现了一种三肽，仅由Glu组成且具有鲜味。Su Guowan等[9]从花生中提取到一种鲜味增强肽和一种鲜味肽。

Hofmann等运用凝胶渗透色谱、HPLC-MS/MS技术结合感官评价手段，对成熟期为44 周的Gouda干酪中的水溶性物质进行了研究[10]。Toelstede等应用感官组学对Gouda干酪的风味进行了深入研究，他们运用凝胶渗透色谱、超滤技术、RP-HPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-飞行时间（time of fl ight，TOF）-MS/MS对干酪中水溶性提取物中的苦味成分进行了鉴定，其中16 种苦味肽被鉴定出来，12 个肽具有较强的苦味[11]。Schlichtherle-Cerny等采用多种蛋白酶复合酶酶解小麦面筋蛋白，得到了去氨基的小麦面筋水解物，然后用凝胶渗透色谱、RP-HPLC、HPLC-MS/MS结合滋味分析对其进行分析，结果表明pGlu-Pro-Ser、pGlu-Pro、pGlu-Pro-Glu、pGlu-Pro-Gln具有滋味活性，是水解液中的滋味活性化合物[12]。有研究发现，热反应后大分子肽降解生成小分子肽，分子质量小于1 000 Da的组分含量显著下降，降解成小分子肽段和游离氨基酸[13]。

本实验使用不同温度热处理后的YE，测定具鲜味的氨基酸和核苷酸的浓度变化趋势；然后结合电子舌数据分析出鲜味最强的样品及温度对样品鲜味的影响；将鲜味最强的样品进一步采用超滤、凝胶过滤、RP-HPLC等技术分离纯化出具有鲜味的肽段，利用超高效液相色谱-四极杆-TOF-MS/MS（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-TOF-MS/MS，UPLC-Q-TOF-MS/MS）对目标肽分子进行打碎，结合肽链的断裂规律，人工解析出目标肽的氨基酸序列。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核苷酸标准品、氨基酸标准品、9-氟甲基氯甲酸甲酯的乙腈溶液（9-f l uorenylmethylchloroformate in acetonitrile，FOMC）试剂、含邻苯二甲醛和3-巯基丙酸的硼酸缓冲液（O-phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid in borate buffer，OPA）试剂、硼酸盐试剂 美国安捷伦科技有限公司；其他相关标准品 美国Sigma公司；甲醇、乙腈（色谱纯） 美国赛默飞世尔公司；酵母膏安琪酵母股份有限公司；超纯水由分子感官科学实验室自制；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1200型HPLC、1290型UPLC、Q-TOF-MS/MS美国安捷伦科技公司；ÄKTA快速纯化系统 美国通用电气公司；Asrree II/LS16型电子舌 法国Alpha MOS公司；LB-32型冷冻干燥机 美国赛默飞世尔公司；切向流超滤系统 美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 YE的制备

设置不同的热反应温度（100、110、120、130、140 ℃），取0.1 g酵母膏加入1 mL超纯水中，锡箔纸密封，置于高压反应釜中反应1 h后，过0.22 μm微孔滤膜，放置于4 ℃冰箱中待测。以未经处理的YE为对照组（CK）。

1.3.2 YE中氨基酸含量的检测

结合HPLC技术，采用钱敏等[14]的方法检测鲜味氨基酸，采用柱前衍生法对样品中的4 种游离氨基酸（天冬氨酸（Asp）、Glu、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala））进行定量分析。将氨基酸混合标准品（1 nmol/μL）用0.1 mol/L HCl溶液稀释，配制成不同浓度（0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 nmol/μL）的混合标准品作标准曲线，采用外标法定量。

HPLC条件：色谱柱：Zorbax Eclipse-AAA（150 mmh4.6 mm，5 μm）；流动相：水相A为0.04 mol/L NaH2PO4溶液（pH 7.8），有机相B为甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）；梯度洗脱程序：0 min，0%流动相B；1.9 min，0%流动相B；18.1 min，37%流动相B；23.2 min，37%流动相B；24 min，100%流动相B；26 min，100%流动相B；27 min，0%流动相B；30 min，0%流动相B。流速：1 mL/min；进样方式：程序进样；进样量：1 μL；紫外检测波长：338 nm；柱温：40 ℃。

自动进样程序：从瓶1（硼酸）中抽取2.5 μL，从样品瓶中抽取0.5 μL，将3.0 μL溶液以最大速率混合2 次，等待0.5 min；在瓶2（超纯水）中清洗进样针；从瓶3（OPA）中抽取0.5 μL，将3.5 μL以最大速率混合6 次；在瓶2（超纯水）中清洗进样针；从瓶4（FOMC）抽取0.5 μL，将4.0 μL以最大速率混合6 次；从瓶5（超纯水）中抽取18 μL，将32 μL以最大速率混合2 次；进样。

1.3.3 YE中核苷酸的检测

5’-核苷酸钠盐是重要的滋味活性物质，采用HPLC技术检测YE中5’-核苷酸钠盐含量，测定方法为：取3 mL样品，超声5 min，过0.22 μm滤膜，置于4 ℃冰箱备用。色谱柱柱温控制为20 ℃，流动相为0.20 mol/L KH2PO4溶液，用磷酸调节pH值为3.8，进样量1 µL，流速1 mL/min。通过5’-核苷酸标准品稀释液作标准曲线进行定量[15]。

分别称取5’-腺苷酸（adenine nucleotide，AMP）、5’-IMP、5’-腺苷酸（cytosine nucleotide，CMP）和5’-GMP 4 种核苷酸各8 mg，定容到10 mL，依次稀释6 个质量浓度梯度（800、400、200、100、40、8 mg/L），做4 种核苷酸的标准曲线，采用外标法定量。

1.3.4 YE中肽分布的测定

为了确定YE在加热过程中的肽分布变化情况，采用HPLC法，使用质量浓度均为2 mg/mL的杆菌肽（Mr＝1 422.69 Da）、FFEFVT（Phe-Phe-Glu-Phe-Val-Thr）多肽（Mr＝789.88 Da）、Glu-Ser-Glu-Cys-Gly（Mr＝448.45 Da）、谷胱甘肽（Mr＝307 Da）、Gly（Mr＝75.07 Da）做分子质量标准曲线[16]。以相对分子质量的对数对保留时间作图得到分子校正曲线及其方程。取3 g YE溶于1 mL超纯水中，经过一定温度热处理，用0.22 μm滤膜过滤，并取1 mL于液相小瓶中备用。流动相采用体积分数20%乙腈-水溶液，用甲酸调节pH值为3.0。流速为0.5 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为220 nm，进样量为1 μL。

1.3.5 YE的滋味分析

采用Asrree型电子舌系统（主要由传感器阵列、自动进样器、数据采集系统以及电子舌配套的数据分析软件组成）。传感器阵列由7 个具有化学选择性区域效应的味觉传感器和1 个Ag/AgCl参比电极组成。这7 个传感器对酸、甜、苦、咸、鲜5 种基本味觉呈味物质都有响应。将处理好的样品放置在设定好的位置上，通过自动进样器使传感器和电极都与样品接触，根据传感器接触样品的电势（V）与参比电极（Ag/AgCl）的电势（V0）的差值进行数据处理和模式识别[17-18]。本实验只检测酸味、鲜味和咸味的强度。

1.3.6 YE中鲜味肽的分离纯化

选取鲜味最强的样品进行冷冻干燥，然后取40 g样品溶于200 mL超纯水。分别用截流分子质量不低于5 000 Da、3 000～1 000 Da和不超过1 000 Da的超滤膜包截流样品溶液，重复多次进行。分别合并多级截留液和透出液，冷冻干燥，用电子舌测定样品鲜味的强度，置于－20 ℃备用[19]。

经过超滤后得到不同分子质量的样品粗组分，取鲜味最强的组分0.1 g溶于3 mL超纯水中备用。使用蛋白纯化仪对不同粗组分进一步的分离纯化[20-21]，凝胶色谱柱用超纯水先经过预平衡和活化，接着用体积分数1%甲酸溶液调整pH值为4，用超纯水再次平衡凝胶柱。仪器洗脱条件为：流动相为超纯水，用体积分数1%甲酸溶液调整pH值为4.0；紫外检测波长：220 nm，流速：0.6 mL/min；分次进样，每次进样量为500 μL，合并相同组分，冷冻干燥后溶解并进行感官评价。

将经过凝胶分离后的滋味活性组分溶解，采用XDB-C18柱进一步分离鲜味肽段组分[22]，以甲醇和水为流动相，紫外检测波长：220 nm，流速5 mL/min，进样量1 000 μL，根据色谱峰收集相关组分，冷冻干燥后溶解并进行感官评价。

1.3.7 UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定肽序列结构

取一定量经过RP-HPLC分离的滋味活性组分采用超纯水溶解，使用Eclipse Plus C18色谱柱，以含体积分数0.1%甲酸的甲醇溶液作为流动相A，体积分数0.1%甲酸溶液作为流动相B，设置流速为0.2 mL/min，进样量为1 μL，柱温调整为30 ℃。MS条件为：正离子模式；毛细管电压：3 500 V；喷嘴电压：500 V；雾化压力：241 kPa；干燥器温度：300 ℃；流量：5 L/min；载气（N2）温度：150 ℃；流量：1 L/min；流速：0.2 mL/min；碰撞能：20 eV；离子扫描范围：m/z 50～1 000[23]。通过肽键两端断裂的碎片鉴定鲜味肽段的序列[24]。

1.3.8 感官评价

味道是人们评估食物可口性的重要指标，是由舌头的味蕾细胞呈现出的化学反应。基本味觉分为酸、甜、苦、鲜、咸5 种。在实验过程中，组织实验室感官评价小组（男性4 名、女性6 名）；感官评价员评价前用标准溶液进行培训：蘸取适量甜味（35 mmol/L蔗糖溶液）、酸味（1.5 mmol/L酒石酸溶液）、咸味（40 mmol/L NaCl溶液）、鲜味（10 mmol/L谷氨酸单钠盐溶液）、苦味（15 mmol/L奎宁溶液）以及5 种溶液的混合液进行品尝训练。制备好样品后，组织感官评价小组对样品进行感官评价，对成品液进行打分（10 分制：0～2 分，很弱；3～4 分，弱；5～6 分，中等；7～8 分，强；9～10 分，很强）。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行显著性分析（单因素方差分析），P＜0.05表示差异显著；使用Origin 8.0软件作图。电子舌数据采用主成分分析法进行分析[25]，根据所得数据建模，相近的数据归为一类或一组[26]。每个样品进行5 次测试，验证滋味的差异。

2 结果与分析

2.1 YE经不同温度热处理后鲜味氨基酸含量的变化

游离氨基酸中，Glu、Ala、Gly及Asp呈鲜味[27]。氨基酸混合标准品标准曲线的线性回归方程如表1所示。

表1 氨基酸混合标准品标准曲线的线性回归方程Table1 Linear regression equation for amino acids

图1 YE经不同温度处理后鲜味氨基酸含量的变化Fig.1 Changes in umami amino acids in YE at different temperatures

由图1可以看出，随着加热温度的升高，YE中的鲜味氨基酸含量有所变化。Glu、Asp、Gly和Ala的含量先下降，在加热温度达到120 ℃后开始上升，由于加热过程中前驱物肽的分布也有所变化，因此可能是肽降解变成氨基酸，影响了氨基酸含量的变化。

2.2 YE经不同温度热处理后核苷酸含量的变化

YE中核苷酸主要包括4 种，以核苷酸二钠盐的形式存在，包括5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP和5’-GMP，其中5’-IMP、5’-GMP是重要的滋味活性物质[28]。核苷酸类也会参与热反应，例如肉中的核苷酸（如肌苷单磷酸盐）加热后产生5-磷酸核糖，经过脱磷酸、脱水形成5-甲基-4-羟基-呋喃酮。羟甲基呋喃酮类化合物很容易与硫化氢反应，产生噻吩类化合物和呋喃类化合物，并产生非常强烈的气味[29]。

图2 YE经不同温度处理后核苷酸含量的变化Fig.2 Changes in nucleotides in YE at different temperatures

如图2所示，样品在100～140 ℃加热过程中，4 种核苷酸的平均含量均呈快速下降的趋势，5’-IMP初始含量为0.733 g/kg，当温度升高到140 ℃时下降到0.155 g/kg；5’-GMP从初始含量0.745 g/kg降低到0.17 g/kg。

2.3 YE经不同温度热处理后肽分布的变化

图3 YE经不同温度处理后肽分布的变化Fig.3 Changes in peptide components in YE at different temperatures

从图3可以看出，随着加热温度的升高，分子质量大于1 000 Da以及500～1 000 Da的组分含量逐渐降低，而300～500 Da以及小于300 Da的组分含量逐渐升高，说明在加热过程中大分子肽类逐渐降解成小分子肽类，且大部分为单个氨基酸或小于五肽的组分，这些化合物作为前驱物又可参与到热反应过程中，形成香气活性化合物。

2.4 YE经不同温度热处理后滋味的变化

图4 YE经不同温度处理后滋味的变化Fig.4 Taste prof i les of YE at different temperatures

如图4A所示，所有的样品都有强烈的酸味，CK组有较强的鲜味，随着处理温度的升高，YE的鲜味明显下降。随着温度的升高，小肽继续参与反应，分子质量大的肽降解为分子质量较小的肽，形成新的肽段。当温度达到110 ℃时鲜味最强，而在140 ℃时鲜味较低。对数据矩阵进行主成分分析，图4B显示不同样品的电子舌传感器信号得分图。PC1和PC2的方差贡献率分别为93.94%、6.05%。CS组能被PC1与其他样品清楚的区分。PC2使100、110 ℃和120 ℃处理组的样品明显在不同位置，130 ℃和140 ℃处理组的样品分布在图片的中部。电子舌能够识别样品中滋味特征的差异，120、130 ℃和140 ℃处理的3 个样品有相似的滋味，而其他3 个样品具有3 种不同的滋味。

2.5 YE经不同温度热处理后鲜味肽的分离纯化结果

图5 超滤截留组分的鲜味评价Fig.5 Evaluation of umami intensity of ultraf i ltration fractions

根据电子舌分析的结果，本研究只利用鲜味最强的110 ℃处理组。从图5中可看出，经过超滤得到的不同分子质量的肽鲜味不同，随着分子质量的减小鲜味增加，不超过1 000 Da组分的鲜味最强。因此使用不超过1 000 Da组分进行下一步实验。

图6 110 ℃处理YE后凝胶过滤色谱图Fig.6 Gel fi ltration chromatogram of YE after treatment at 110 ℃

如图6所示，根据峰形将样品分为5 组，其中GEL-2峰丰度最高。将凝胶过滤组分大量分离制备后冷冻干燥，进行感官评价（表2）。其中GEL-2、GEL-3都具有鲜味，得分分别为7.35±0.82和1.32±0.61，选择GEL-2组分进行下一步分离纯化实验。

GEL-2组分经RP-HPLC分离纯化得到4 个峰（图7）。如表3所示，F1、F3、F4组分具有鲜味，得分分别为7.90±0.36、9.03±0.62、5.83±0.25。收集具有鲜味的肽段进行下一步实验。

表2 凝胶过滤各组分滋味的感官评价Table2 Taste prof i les of fractions obtained by gel permeation chromatography

图 7 GEL-3组分的RP-HPLC图Fig.7 RP-HPLC chromatogram of fraction GEL-3

表3 RP-HPLC各组分的滋味分析Table3 Taste pro fi les of RP-HPLC subfractions

2.6 YE经不同温度热处理后鲜味肽的鉴定结果

表4 YE肽RP-HPLC组分中肽序列结构的鉴定及二级离子碎片归属Table4 Fragment ions and proposed peptide sequences of selected peptides in RP-HPLC subfractions

研究表明，在多肽的碰撞诱导解离过程中，肽链一般在化学能较低的肽键处断裂。由n 个氨基酸脱水缩合而成的多肽，在由N端开始的第m个氨基酸与第（m＋1）个氨基酸之间发生了断裂，根据断裂位点与肽键的关系，会产生a-x、b-y和c-z型3 种断裂方式，其中，肽链N端的子离子碎片连续命名为am、bm、cm离子，C端的子离子碎片连续命名为xm、ym、zm离子。在Q-TOF-MS/MS中，b-y型断裂为常见的方式；此外，am-NH3、ym-H2O等也是常见的子离子碎片类型[30]。

将收集得到的RP-HPLC组分依次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS检测，利用其对目标肽分子进行打碎，结合肽链的断裂规律，人工解析出4 条具有鲜味的肽段（表4）。典型的MS/MS图如图8所示。在110 ℃处理的样品中鉴定出的鲜味肽段为Gln-Leu、Pro-Glu-Thr、Ala-Pro-Ala和His-Val。

图 8 110 ℃处理后鲜味肽段的UPLC-Q-TOF-MS/MS图Fig.8 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis of umami peptides in YE after treatment at 110 ℃

3 结 论

YE是一种天然新型调味品，作为复配料被广泛应用于食品生产中，在加工食品的调味料中具有广阔的应用前景。在热处理过程中，YE中的滋味物质含量和小分子滋味肽结构上有所变化，所产生的呈味化合物也有所不同。然而，对于热处理对其滋味的影响研究甚少。本研究在不受其他因素干扰的条件下，以单一的热处理温度为因素，分析具有鲜味的化合物的变化规律并鉴定鲜味肽段，找到最适温度以达到其鲜味增强的效果。结果表明，温度对热反应的影响很大，热处理温度为110 ℃时鲜味最强。本研究结果为酵母提取物在加工食品中的进一步应用提供了良好的理论依据。本研究只选择温度作为影响因素，因此需要进一步研究底物浓度、pH值和反应时间的影响，找到最佳的热反应条件以提高YE的鲜味。