钙调蛋白依赖性激酶IIγ RNA干扰载体构建及对破骨细胞分化和骨吸收的影响

王艺睿 王会 戚孟春 董伟 冯晓洁 孙红

华北理工大学1口腔医学院口腔颌面外科教研室，2基础医学院病理教研室（河北唐山063000）

破骨细胞分化与功能异常在牙周炎、骨质疏松等多种骨过度吸收疾病中起重要作用［1-2］。抑制破骨细胞介导的骨吸收是这些疾病治疗的重要途径，因而调节破骨细胞分化的研究很重要。钙离子∕钙调蛋白依赖性激酶II（Ca2+∕calmodulin- dependent protein kinase II，CaMKII）是胞内Ca2+信号传递的关键信号分子［3］；在CaMKII 诸多异构体中，CaMKIIγ 在破骨细胞分化中表达较高［4-5］，提示其作用非常关键；但其具体作用及分子机制目前尚不清楚。本研究通过构建CaMKIIγ 慢病毒干扰载体，研究其对破骨细胞分化及骨吸收的影响，以探索CaMKIIγ 对破骨细胞分化的影响，后期分子机制研究及骨过度吸收性疾病的治疗以此为实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验用品 小鼠RAW264.7 细胞株，上海细胞库，中国；核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），Biovision，美国；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphotase，TRAP）染色试剂盒，Sigma，美国；CaMKIIγ 单克隆抗体，Abcam，日本；PCR 引物，博尚生物，中国；慢病毒载体，上海吉凯基因公司，中国。

1.2 CaMKIIγ 干扰载体构建及转染效率测定针对CaMKIIγ 基因编码序列（NM-001039139），根据RNAi 设计原则筛选3 个RNAi 靶点，序列分别为：#1，5′-TAGAGTGCTTACGCAAATT-3′；#2，5′-TTGCTGCTGGCGAGTAAAT - 3′ ；#3，5′ - ACGCAGGAATATGCTGCAA-3′。以5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′序列为RNAi 阴性对照。将合成的干扰序列与携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒载体pGCSIL-GFP连接形成#1、#2、#3重组干扰载体，并包装与辅助载体pHelper 2.0共转染293T 细胞；提取重组病毒液，放置-80 ℃备用。以上由上海纪凯基因公司协助完成。

在感染复数（multiplicity of infection，MOI）值分别为1、10、30、50下，用阴性载体转染RAW264.7 细胞，12 h 后换新鲜培养基；转染5 d 后激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）下观察GFP 表达情况，确定最适MOI值，计算转染效率（GFP 阳性细胞数∕所测细胞总数×100%）。

1.3 重组载体干扰效率测定

1.3.1 实验分组 RAW264.7 细胞按5 × 103∕孔接种到直径为30 mm 的培养皿中培养。细胞分为5组，分别为对照组（未用病毒转染）、阴性载体转染组、#1、#2、#3 干扰载体组。转染12 h 后，更换含有50 ng∕mL RANKL、10%FBS 的DMEM 培养基继续培养，诱导向破骨细胞分化；于第5 天收获细胞进行干扰效率检测。

1.3.2 实时荧光定量PCR 检测 5 组细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR 仪上进行变性、退火、延伸；引物序列：CaMKIIγ（409 bp），正义链5′-GCATGTACCC ACAAAGGGGT-3′，反义链5′-GCTGGCTCCATACTCTGTAGTTC-3′；β-actin（186 bp），正义链5′-GTTG GAGCAAACATCCCCCA-3′，反义链5′-CGCGACCAT CCTCCTCTTAG-3′。反应条件：95 ℃30 s，95 ℃15 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，45 cylces。用Rotor-Gene 软件分析5 组CaMKIIγ mRNA水平，确定#1、#2、#3 病毒mRNA 干扰效率。

1.3.3 Western blot 检测 提取需测细胞的总蛋白，测浓度，加上样缓冲液，100 ℃变性；蛋白上样后，电泳，转膜，室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育2 h；对照为β-actin；显影，用成像系统采集图像，分析蛋白条带吸光度值，并计算其与β-actin 吸光度值的比值，作为该组CaMKIIγ 蛋白表达水平。

1.3.4 CaMKIIγ RNA 干扰对破骨细胞生成及骨吸收功能的影响 实验分组：细胞分为对照组、阴性载体组、干扰载体组（使用干扰效率最佳的干扰载体）。TRAP 检测：细胞按5 × 103∕孔接种到30 mm 直径的培养皿中，按1.3 方法转染并继续诱导培养。诱导5 d 后，收获细胞并按照试剂盒说明书进行TRAP 染色，200 倍显微镜下观察。每张细胞爬片随机取6 个视野，计算TRAP+且胞核≥3 个的细胞数目，取其平均值；每组测量3 个细胞爬片。骨吸收陷窝检测：用离体牙制备1 mm 厚牙本质磨片；细胞按5 × 103∕孔接种到有牙本质磨片的24 孔板中。培养方法同TRAP 染色。7 d 后收获牙本质磨片，扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）观察；500 倍下每个磨片上选6 个视野，测骨吸收陷窝总数及总面积，取均值，作为该磨片吸收陷窝数目及面积；每组测3 个磨片。

1.4 统计学方法 定量数据用均数± 标准差表示，SPSS 17.0 软件统计分析。单因素方差分析比较多组定量数据，LSD 法进行多组内两两比较；P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CaMKIIγ 干扰载体构建及转染效率测定本研究成功构建了3 个CaMKIIγ RNA 干扰载体。用阴性载体转染RAW264.7 细胞，绿色荧光蛋白（GFP）随MOI 值增加表达增强。MOI 值为1、10、30、50 时，病毒转染效率分别为4.0%、12.2%、80.9%、87.1%（图1）；但MOI 值为50 时，部分细胞变形、崩解，故本实验确定病毒最佳MOI 值为30。

2.2 CaMKIIγ RNA 干扰效率测定

2.2.1 PCR 检测mRNA 水平干扰效率 在qPCR仪上进行CaMKIIγ 基因及管家基因β-actin 的PCR反应，将对照组中第一个复孔的mRNA 表达量定义为1，则#1、#2、#3 干扰载体组相对于对照组的mRNA 水平分别为0.377 ± 0.031、0.477 ± 0.042 和0.230 ± 0.020，较对照组（1.100 ± 0.089）均显著降低（P ＜0.01），分别下降了64.20%、54.61%和78.16%；而阴性载体组（1.053± 0.416）与对照组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。上述结果提示，#3 干扰载体组mRNA 干扰效率最佳。

图1 阴性载体转染RAW264.7 细胞后最佳MOI 值确定（激光共聚焦显微镜，×200）Fig.1 Determination of optimal MOI value in RAW264.7 cells after transfection with negative vector（LSCM，×200）

2.2.2 Western blot 检测CaMKIIγ 蛋白表达水平RAW264.7 细胞经病毒转染5 d 后，蛋白质印记检测显示，#1、#2、#3 干扰载体组CaMKIIγ 蛋白表达较对照组明显降低（图2）。定量分析表明，#1、#2、#3 干扰载体组蛋白表达光密度值与内参β-actin 光密度值的比值分别为0.579 ± 0.104、0.404 ± 0.088和0.374 ± 0.108，较对照组（1.134 ± 0.141）分别下降了48.94%、64.37%和67.02%（P ＜0.01）；而阴性载体组与对照组（0.988 ± 0.073）无明显差别（P ＞0.05）。上述结果说明，#1、#2、#3 干扰载体对CaMKIIγ 蛋白表达进行了有效干扰，其中#3 干扰载体效果最佳。上述结果与mRNA 表达一致，因此选用#3 干扰载体用于下一步实验。

2.3 CaMKIIγ RNA 干扰对破骨细胞生成及骨吸收的影响 TRAP 染色阳性多核破骨细胞在3 组细胞中均出现；其中对照组和阴性载体组多核破骨细胞数较多，体积较大，而干扰载体组破骨细胞数目较少，体积较小（图3）。定量分析表明（表1），干扰载体组破骨细胞数较对照组下降了59.99%（P ＜0.01）；而阴性载体组与对照组间差异无显著性（P ＞0.05）。上述结果提示，CaMKIIγ RNA 干扰可显著抑制破骨细胞生成。

图2 蛋白质印记法检测5 组CaMKIIγ 蛋白表达Fig2 Detection of CaMKIIγ protein expression in five groups by Western-blot

SEM 显示，3 组细胞均出现了不同数量的骨吸收陷窝，但干扰载体组较其他两组骨吸收陷窝数目较少、面积较小（图3）。定量分析显示（表1），干扰载体组骨吸收陷窝数目及面积较对照组分别下降了54.19%和57.94%（P ＜0.01）；而阴性载体组与对照组比差异无统计学意义（P ＞0.05）。上述结果表明，CaMKIIγ RNA 干扰可显著抑制破骨细胞骨吸收功能。

3 讨论

原发性∕转移性骨肿瘤、牙周炎、种植体周围炎、骨质疏松等疾病中的骨吸收均与破骨细胞分化与功能异常有关，因而破骨细胞分化调控研究是国内外学者关注的焦点。RANKL 作用于破骨细胞膜受体RANK 并募集胞内TRAF（TNF receptor-associated factors），进而通过Ca2+、NF-κB、MAPKs、Akt 等信号通路调控破骨细胞分化［6］。有研究已经确定NF-κB 途径是CaMKIIδ 和CaMKIIγ 下游激活的主要信号通路之一［7］。CaMKII、CaMKIV 均是胞内Ca2+信号传递的关键分子［3，6］。PARK-MIN［8］及WILLIAM 等［9］研究发现，RANKL 可促进破骨细胞分化早期CaMKII 磷酸化，提高其蛋白活性，提示其在破骨细胞分化中也可能发挥关键作用。

图3 3 组破骨细胞生成（上排，TRAP 染色，×200）及牙本质吸收陷窝（下排，SEM，×500）Fig.3 Detection of osteoclastogenesis（upper row，TRAP staining，×200）and absorption lacunaes on dentin slices（lower row，SEM，×500）in three groups

表1 破骨细胞计数及牙本质磨片吸收陷窝定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

表1 破骨细胞计数及牙本质磨片吸收陷窝定量分析Tab.1 Quantitative analysis of osteoclast number and dentin resorption lacunaes（n=3） ±s

注：与对照组比较，aP ＜0.01

分组对照组阴性载体组干扰载体组F 值P 值破骨细胞数（个）26.670±1.528 23.330±2.517 10.670±1.528a 58.303＜0.01吸收陷窝数（个）16.000±1.000 13.670±1.528 7.330±1.528a 31.941＜0.01吸收陷窝面积（μm2）1 1701.000±361.805 1 1191.000±286.606 4 922.000±64.086a 590.703＜0.05

CaMKII 有α，β，γ 和δ 四个异构体［10］。YAO等［4］研究发现，CaMKIIγ 在破骨细胞分化的第3、5天表达上升，而在分化结束时恢复正常，从而认为其主要在破骨细胞分化早期阶段发挥作用。而ANG 等［5］研究显示，CaMKIIγ 在RANKL 诱导的破骨细胞分化中一直稳定高水平表达，而CaMKII 其他异构体及CaMKIV 不表达或表达水平较低。CaMKIIγ 在破骨细胞分化中表达水平较高，且呈时间依赖性表达增强，其表达规律与CaMKIIδ 相似［7］。本课题组前期研究发现，CaMKIIδ RNA 干扰能够使破骨细胞受到抑制，而且TRAP、NFATc1、c-Src（非受体酪氨酸激酶）等破骨细胞分化相关因子的基因表达下降；CaMKIIδ 过表达对破骨细胞分化和骨吸收无明显影响［11］。破骨细胞是由分化的巨噬细胞形成的多核细胞，具有破骨功能。TIMMINS等［12］研究发现巨噬细胞中的CaMKIIγ 活化可以引发细胞凋亡。上述研究均说明CaMKIIγ 在破骨细胞分化调控中可能发挥重要作用；然而，其发挥的作用及可能的下游信号分子目前还知之甚少。

为了进一步探索CaMKIIγ 在破骨细胞分化中的作用，本实验应用慢病毒构建CaMKIIγ RNA 干扰载体；结果发现，CaMKIIγ 基因沉默可显著抑制破骨细胞生成及骨吸收功能，使破骨细胞数较对照组下降了59.99%，骨吸收陷窝数目和面积分别下降了54.19%和57.94%，提示CaMKIIγ 在破骨细胞分化中发挥着关键调控作用；该研究结论与Ang等的研究相一致。ANG 等［5］应用CaMKs 特殊抑制剂KN93、KN62 显著抑制了RANKL 诱导的破骨细胞生成、骨吸收及Cathepsin K 表达；而应用抑制剂KN92（对CaMKII 不起作用）则对破骨细胞生成无显著影响；由于该研究同时证实在破骨细胞分化中CaMKIIγ 表达较高，而CaMKII 其 他 异构体及CaMKIV 不表达或表达水平较低，因而支持本研究CaMKIIγ 在破骨细胞分化中起关键调控作用的结论。

有关CaMKII 对破骨细胞分化调节的机制，目前还知之甚少，可能与MAPK、CREB、Akt 等信号分子有关。

MAPK 家族包括信号分子ERK、JNK 和P38。ERK 的磷酸化对破骨细胞存活非常重要［13］；同时ERK 的持续活性可诱导integrinαvβ3 表达从而在破骨细胞分化的细胞融合阶段发挥作用［14］。YAO等应用CaMKs 抑制剂KN93 处理骨髓单核细胞，发现其显着抑制早期RANK 下游信号分子中ERK 和Akt 蛋白活化［15］；认为CaMKII 可能通过调节ERK和Akt 影响破骨细胞早期分化［4］。ANG 等［5］研究显示，CaMKs 抑制剂KN93 和KN62 可显著抑制破骨细胞内RANKL 诱发的CREB 转录活性及ERK 磷酸化，提示二者在CaMKII（γ）介导的破骨细胞分化中发挥关键作用。由于MAPK 是RANK 下游信号分子，因而CaMKII 通过ERK 与RANK 间存在信号相互作用。PARK-MIN 等［8］也提出，在MEKERK 信号传导途径中RANK 和CaMKII 之间存在交叉。我们前期研究发现［16］，CaMKIIδ 基因沉默可显著抑制破骨细胞生成及骨吸收，并下调CREB、ERK、JNK、P38 蛋白磷酸化水平；而ERK、JNK、P38特异抑制剂对破骨细胞分化产生相似的抑制作用，从而说明这些信号分子参与了CaMKIIδ 对破骨细胞分化的调控，同样说明CaMKII 和RANK 之间存在信号交叉。在神经细胞中CaMKIIγ 将Ca2+∕钙调蛋白从神经元表面转运到细胞核，使CREB 磷酸化和基因表达［17］。前面提到CaMKIIγ 表达规律与CaMKIIδ 相似，是否CREB、ERK、JNK 等信号分子参与CaMKIIγ 对破骨细胞分化的调控，其调控的分子机制有待进一步研究。

总之，本研究成功构建了CaMKIIγ 慢病毒干扰载体，并证实CaMKIIγ 可显著抑制破骨细胞分化及骨吸收功能，提示CaMKIIγ 在破骨细胞分化中发挥关键调控作用，为后期CaMKIIγ 的相关信号分子机制研究及临床治疗骨吸收性疾病提供实验依据。