油茶籽美拉德反应及其产物抗氧化性

2019-03-08费学谦钟海雁

中国粮油学报 2019年2期

杨楠罗凡费学谦钟海雁

(中南林业科技大学食品学院1，长沙 410004)(中国林业科学研究院亚热带林业研究所2，杭州 311400)

美拉德反应是指氨基化合物和羰基化合物之间发生的非酶促褐变反应[1]。美拉德反应进程包括初始、中间和最终阶段等三个阶段，而且美拉德反应产物(Maillard Reaction Products，MRPs)种类繁多。MRPs包括还原酮，杂环化合物，类黑精等，其中某些物质具有显著的抗氧化性[2-3]。MRPs不仅对食品的色泽、风味有重要贡献，还具有抗诱变作用[4]、抗肿瘤作用[5]、抗增殖作用[6]、降血压作用[7]等生物活性，对于防治疾病，提高人类身体健康方面有重要意义。

Durmaz等[8]研究了焙烤对杏仁油氧化稳定性和抗氧化能力的影响，结果表明：180 ℃下，随着焙烤时间增加，杏仁油氧化稳定性和抗氧化能力呈增强趋势，得出可以通过适当的烘烤来改善油性坚果和种子的保质期，进一步研究MRPs可以保护分子结构防止油氧化变质。陈海光等[9]研究了模式美拉德体系产物对油脂抗氧化性能的影响，结果表明：3%半胱氨酸,1%葡萄糖，以及0.5%盐酸硫胺素混合于100 g的甘油中，调pH值8，在110 ℃下反应1.5 h，制得的美拉德反应产物向油脂中添加1%，测得油脂的抗氧化性最好。Severini等[10]研究了榛子美拉德产物在烘烤和贮藏过程中脂质氧化的相互作用，实验证明：150 ℃下的榛果油中MRPs可以减少榛果油的脂质氧化。

油茶籽在生产和压榨过程中可能会经过剥壳、破碎、蒸炒[11]等高温工艺，具有产生美拉德反应的温度条件。本研究针对油茶籽中美拉德反应发生的温度条件，美拉德反应发生的指标及其产物的抗氧化性进行探索，以期摸清油茶籽在加工过程中物化特性的变化规律，为优化油茶籽加工工艺以及油茶籽油营养品质的研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜成熟的油茶籽经干燥后分别经过30、60、90、120、150 ℃烘箱加热处理0、20、40、60 min后分别得到液压压榨油冷藏备用与脱脂油茶籽粉：处理后的油茶籽经粉碎、浸提、干燥后冷藏备用。

葡萄糖标准品(纯度98%)；2，2-联苯基-1-苦基肼基(96%)；2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(98%)；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验仪器

UV-2550紫外分光光度计；DGG-9140电热恒温鼓风干燥箱；XW-80A涡旋混合仪；Avanti J-E离心机；MTN-2800D氮吹仪；CM-3600A分光测色计。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反应产物提取

称取5 g的脱脂油茶籽粉，加入乙酸乙酯50 mL，置于高速均质机中均质提取5 min后，在置于高速离心机10 000 g、4 ℃离心10 min。取上清液，氮气吹干，并用甲醇定容至10 mL，冷藏备用[12]。

1.3.2 美拉德反应底物和水分的测定

还原糖和水分测定分别参考国标NYT 1278—2007/IVS 67.080.20[13]和GB 5009.3—2016[14]。

游离氨基酸的测定参照Benjakdl等[15]的方法并稍作修改。取125 μL反应液与2.0 mL 0.212 5磷酸盐缓冲液(pH8.2)混合，加入0.01%TNBS溶液1.0 mL，充分混合后，在50 ℃水浴中避光反应30 min。加入2.0 mL 0.1 mol/L Na2SO3终止反应，冷却15 min，于波长420 nm处测定吸光值。

1.3.3 美拉德反应指标的测定

褐度的测定：取1 g脱脂油茶籽粉，加入20 mL50%乙醇，在高速均质机作用下，冰浴中提取10 min。提取液于4 ℃、10 000 g条件下离心10 min，过滤脱脂，收集滤液。分别在294 nm处测定美拉德反应产物的紫外吸光度和420 nm处测定美拉德反应产物的吸光值[16]。

色值的测定：采用投射模式光路长度为10 mm，测量面尺寸为55 nm×57 mm的光学清洁玻璃制成的比色皿[17]。在仪器校正时，以去离子水作为校正标尺。校正完毕后，约20 mL压榨油倒入比色皿中，进行测定。

pH测定：称取0.5 g脱脂油茶籽粉与10 mL蒸馏水混合并剧烈振荡10 min后5 000 g离心3 min，弃去沉淀，用pH计测定上清液的pH值[18]。

1.3.4 美拉德反应产物的抗氧化活性

DPPH法：取1 mL反应液，加入0.2 mmol/LDPPH甲醇溶液3 mL。室温条件避光反应30 min，以甲醇做参比，517 nm波长下测其吸光值。DPPH自由基清除活性按公式计算[19]：

自由基清除活性=A0(A1-A2)/A0×100%

式中：A0为未加MRPS时DPPH溶液的吸光度；A1为MRPS反应一定时间后DPPH溶液的吸光度；A2为美拉德反应产物的吸光度。

ABTS测定：取1 mL反应液，加入ABTS工作液3 mL充分混匀。避光反应30 min，以甲醇做参比，734 nm波长下测其吸光值，ABTS自由基清除活性按公式计算：

自由基清除活性=(A空白-A样品)/A空白×100%

2 结果与讨论

2.1 美拉德反应前体物

2.1.1 还原糖含量的分析

还原糖作为美拉德反应的初始物，其含量测定结果如图1所示。实验结果表明随着加热时间的延长只有在30 ℃时还原糖含量是增加的，在60、90、120、150 ℃时随着加热时间的增加，还原糖含量是减少的。可能在60、90、120、150 ℃有美拉德反应发生消耗了还原糖至其含量减少。研究发现，在低温的条件下随着储藏的时间延长还原糖的含量是增加的[20]。这可能是油茶籽在未经过热处理时还原糖含量增加的原因。

图1 美拉德产物还原糖含量的变化

2.1.2 游离氨基酸的分析

游离氨基酸是美拉德反应另一初始物，反应前后油茶籽中游离氨基酸的测定结果如图2所示。

图2 美拉德产物游离脂肪酸含量的变化

游离氨基酸含量的变化反应美拉德进行程度，游离氨基酸减少的程度越大，反应进行越深[21]。从图2可以看出，在相同的加热温度下，随着时间的延长，游离氨基酸酸含量是先降低后趋于平稳。这是因为随着反应的进行有高分子质量的产物生成，从而使游离氨基酸含量逐渐降低。另外，随着反应温度的提高游离氨基酸含量降低幅度增大，说明温度的提高有利于美拉德反应产物的生成。这与Naranjo等[22]对酪蛋白与还原糖进行美拉德反应研究的规律相似。

2.2 美拉德反应指标

2.2.1 水分的分析

含水分也是研究美拉德反应进程的一个指标，油茶籽加热前后水分变化如图3所示。

图3 美拉德产物水分的变化

从图3可以看出，看出在相同的加热温度下，随着时间的延长，水分是先降低后趋于平稳。在30 ℃时下降不明显，而在120、150 ℃加热40～60 min时下降最多，水分分别降低了0.062、0.09 g/100 g。油茶籽经过加热处理后其水分含量降低，可能会提高茶油的抗氧化性[23]。

2.2.2 褐度的变化

蛋白质与糖反应往往伴随着褐变现象，这一类物质统称类黑素。本研究通过测定294、420 nm吸光度来反映褐变程度与类黑素的生成量，以及美拉德不同阶段的反应程度。其中294 nm的吸光度值用于表征中间美拉德反应产物(图4)，420 nm的吸光度值用于表征末期美拉德反应产物-类黑精[24-25 ](图5)。

实验结果表明，经加热处理后油茶籽的吸光度明显增加，其中较为明显的是120 ℃和150 ℃。随着反应时间的延长，吸光值增加，溶液颜色逐渐加深，表明形成了褐色的聚合体-类黑精。类黑精是美拉德反应中主要抗氧化成分。由于类黑精是一种以短肽和色素相结合的混合体，美拉德反应时间越长，有利于色素物质产生，从而加深了反应产物的褐变程度。随着美拉德反应时间的延长，产物的抗氧化能力也显著增强[26]。这可能是因为在类黑精混合体中，其短肽的氨基酸序列结构具有抗氧化肽的特征，因而具有抗氧化活性。

图4 美拉德反应中间产物的变化

图5 美拉德反应最终产物的变化

2.2.3 色值的分析

美拉德反应产物并非单一物质，而是十分复杂的物质体系，既有一些低分子量的化合物，也有一些例如类黑素等高分子质量的物质。所以单一的波长并不能完全反映美拉德反应产物的真实颜色。本研究通过色差计测定反应体系的颜色变化(表1)，以期能全面反映美拉德反应不阶段产物的色泽指标。

从表6可以看出，随着反应时间的延长L*值、b*值先增大后减少，a*值先减小后增大。随着加热时间的延长，油茶籽油颜色逐渐加深，在30、60、90 ℃时40 min之前变化的不是特别明显，90 ℃在40 min后颜色急剧加深尤其是在150 ℃加热后颜色比较深。结果表明加热温度会导致油茶籽油颜色的变化，温度越高颜色越深；加热时间也会影响油脂颜色变化，但没有温度影响明显。

表1 美拉德产物色值的变化

2.2.4 pH值的分析

油茶籽加热前后pH变化如图6所示。

图6 美拉德产物pH值变化

从图6中得知油茶籽美拉德反应产物的pH值小于7,且随加热时间的延长，pH值先升高后降低，随温度的升高pH值增大，在20 min时pH值最大。可能是氨基酸的碱性基团-氨基在加热过程中不断与还原糖羧基缩合，使得游离的氨基酸被封闭，致使体系的pH值不断下降。

2.3 美拉德反应产物抗氧化性分析

DPPH·可以用于反映物质的抗氧化性。本研究测定加热前后油茶籽中美拉德反应产物清除DPPH·自由基的能力(图7)。

由图7可知，不同反应温度和反应时间提取的美拉德反应产物都具有一定的清除DPPH·作用，并且清除自由基能力随着反应时间延长而增加。120、150 ℃下的美拉德产物的自由基清除能力呈相同的趋势，40～60 min时自由基清除率显著增加，在反应60 min时达到最高分别是43.06%和48.87%。

图7 美拉德产物清除DPPH·能力变化

ABTS·也可以反映物质的抗氧化性。本研究测定了加热前后油茶籽中美拉德反应产物清除ABTS+·自由基的能力(图8)。不同反应温度和反应时间提取的美拉德产物都具有清除ABTS+·的作用，并且清除自由基能力随着反应时间延长而增强。150 ℃下的美拉德产物的自由基清除能力最强，在反应60 min时达到最高为89.9%。