白鲜皮化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性

杨晓军，艾凤凤，蔺军兵，汤江江

(1延安大学化学与化工学院,延安 716000；2延安市分析技术与检测重点实验室,延安 716000；3西北农林科技大学化学与药学院,杨凌 712100)

据世界卫生组织统计资料表明，糖尿病已成为继心脑血管疾病和肿瘤之后，严重威胁人类健康的第三大疾病。糖尿病是由遗传和环境因素相互作用引起的常见病，临床以高血糖为主要标志[1]。α-葡萄糖苷酶抑制剂能够有效推迟并减轻糖尿病人餐后血糖升高的时间和进程，有助于控制糖尿病的发展以及并发症的发生[2-3]。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂的种类较少，价格较昂贵，且有一定的不良反应。因此，寻找高效低毒且价格低廉的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为当前国内外学者研究的热点之一。

近年来，本课题组立足于从陕北药用植物资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，结果发现白鲜皮石油醚提取部位对α-葡萄糖苷酶有强烈的抑制作用。基于此基础，本课题组对该部位化学成分进行分离纯化，从中分离得到5个单体化合物，其结构见图1。采用对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法测试单体化合物的活性，旨在为白鲜皮作为治疗糖尿病的中药材提供科学依据。

Figure 1 Structures of compounds 1- 5 isolated from the petroleum ether extract of Dictamnus dasycarpus

1 材 料

1.1 药 材

白鲜根皮样品于2017年10月采购于陕西绥德，经延安大学生命科学院白重炎研究员鉴定为芸香科白鲜属白鲜Dictamnusdasycarpus.的干燥根皮，标本存放于延安大学天然产物化学实验室,标本编号为YD20171004。

1.2 仪 器

X-4型显微熔点仪(上海科学仪器有限公司)；IR Prestige-21红外光谱仪(日本岛津公司)；AV-500型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)，TMS为内标；MAT-711型质谱仪(美国Thermo公司)；Vario EL有机元素分析仪(德国Elementar公司);BioTek Epoch全波长酶标仪(美国BioTek公司)1525型高效液相色谱仪(美国Waters 公司)；JP600型超声波提取器(武汉嘉鹏电子有限公司)。

1.3 试 剂

Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司)；柱色谱硅胶100～200目(青岛海洋化工厂产品)；对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，阿卡波糖[阿拉丁试剂(上海)有限公司],α-葡萄糖苷酶(美国Sigma公司)；所用溶剂及试剂均为市售分析纯。

2 提取和分离

称取白鲜皮2.5 kg(干重)，用粉碎机将其粉碎成粉末。将此粉末在超声波辅助下用70%的乙醇提取，提取液减压浓缩后得棕色浸膏245 g。将此浸膏加水溶解混悬后，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，各萃取液浓缩后，分别得石油醚萃部位19 g，乙酸乙酯萃部位32 g。将石油醚萃取部位用硅胶柱色谱分离，以石油醚-氯仿梯度洗脱(100∶0→1∶1)，薄层色谱(TLC)检识，合并相同流分(Fr.),得到Frs.1～7。Fr.1用硅胶柱色谱(石油醚-氯仿，50∶1)分离得化合物1(43 mg)；Fr.2,3段用硅胶柱色谱(石油醚-氯仿，30∶1)分离，根据TLC检识，合并相同部分，合并部分再用石油醚重结晶得化合物2(21 mg)；Fr.4用硅胶柱色谱(石油醚-氯仿，20∶1)分离，再经Sephadex LH-20(丙酮为洗脱剂)纯化得化合物3(62 mg)；Fr.5用硅胶柱色谱(石油醚-氯仿，20∶1)分离得化合物4(49 mg)；Fr.6,7用硅胶柱色谱(石油醚-氯仿，9∶1)分离，根据TLC检识，合并相同部分，合并部分再用甲醇重结晶得化合物5(70 mg)。

3 结构鉴定

化合物1白色蜡状固体，mp 72.1～73.5 ℃。ESI(+)-MS显示准分子离子峰m/z326[M]+；元素分析得知碳、氢的百分含量分别为：79.81和14.03；质谱和元素分析提示该化合物的分子式为C22H46O。IR(KBr) νmax3 246(-OH),2 958,2 930,2 872,2 856,721 cm-1。1H NMR(500 MHz,CDC13)δ:3.64(2H,t,J=6.4 Hz,H-1)，1.46(2H,m,H-2),1.23～1.35(38H,m,H-3～21,19×CH2),0.89(t,3H,H-22);13C NMR(125 MHz,CDC13)δ:62.9(C-1),33.1(C-2),26.1(C-3),28.6(C-4),28.7(C5-18),28.5(C-19),32.0(C-20),21.9(C-21),14.4(C-22)。以上数据与文献[4-5]报道的docosanol数据基本一致，故鉴定此化合物为二十二烷醇。

化合物2白色粉末，mp 152.3～153.6 ℃。硫酸-茴香醛-乙醇试剂显紫红色斑点，提示含有酯基。HR-ESI-MSm/z:586.2 837[M]+(C43H38O2,计算值586.286 2)，确定相对分子质量为586，分子式为C43H38O2,不饱和度为25。IR(KBr)νmax171 9(羰基C=O伸缩振动吸收峰)、1 601，1 547，1 471 cm-1为苯环的骨架伸缩振动吸收峰，753、703 cm-1为苯环的单取代的特征吸收峰信号；13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) 共给出了9个碳信号(表1)，包括1个甲基信号(δC14.2)、1个连氧亚甲基信号(δC60.5)、1个sp3杂化次甲基碳信号(δC40.1)、1个sp3杂化季碳信号(δC68.2)、1个羰基碳信号(δC172.3)、1个芳香季碳信号(δC138.4)和3个芳香叔碳信号(δC129.3、130.2、133.8)；结合化合物2有25个不饱和度，减去1个羰基，结构中可能还含有6个苯环。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)(表1)给出了1个乙氧基(-OCH2CH3)δH4.12(2H,q,J=6.8 Hz)、1.26(3H,t,J=6.2 Hz)信号，3个次甲基(>CH-)δH3.06(s)信号，一组苯环单取代结构信号δH8.14(12H,dd,J=7.8,7.6 Hz)，7.64(6H,d,J=7.6 Hz),7.46(12H,d,J=7.8 Hz)。综合以上信息分析，推断该化合物中含有1个羰基、1个乙氧基、3个相同的次甲基、6个相同的单取代苯环和1个sp3杂化季碳。各取代基连接次序可通过分析HMBC谱确定。在HMBC谱(表1)中单取代苯环中的δH7.46(H-2′,6′)与δC40.1(C-3)和δC129.3(C-4′)相关，表明苯环与此次甲基碳相连，δH4.12(H-1″)的亚甲基氢与δC172.3羰基碳(C-1)相关，从而可以进一步确定该乙氧基片段-OCH2CH3与羰基相连接，也为1个酯基片段-COOCH2CH3；综合分析该化合物的所有结构片段及其分子的对称性，化合物2可被推定为2,2-二二苯甲基-3,3-二苯基丙酸乙酯，该化合物为一新化合物。

Table 1 1H NMR(500 MHz,DMSO-d6),13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) and HMBC spectral data of compound 2

化合物3无色针晶，mp 228.6～229.7 ℃；ESI-MSm/z:471.5[M+H]+,分子式C26H30O8。1H NMR(500 Mz,CDCl3)δ:3.98(1H,dd,J=13.8,1.2 Hz,H-1),2.65(1H,d,J=1.2 Hz,H-2a),2.95(1H,d,J=13.8 Hz,H-2b),2.24(1H,dd,J=11.8,1.8 Hz,H-5),2.48(1H,d,J=1.8 Hz,H-6a),2.83(1H,d,J=11.8 Hz,H-6b),2.57(1H,dd,J=9.8,1.6 Hz,H-9),1.84(2H,m,H-11),1.51(1H,d,J=1.7 Hz,H-12a),1.62(1H,d,J=11.6 Hz,H-12b),4.06(1H,s,H-15),5.32(1H,s,H-17),1.13(3H,s,H-18),4.65(2H,s,H-19),7.42(1H,s,H-21),6.52(1H,d,J=8.9 Hz,H-22),7.46(1H,d,J=8.9 Hz,H-23),1.05(3H,s,H-24),1.21(6H,s,H-25,26);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:78.1(C-1),35.7(C-2),169.7(C-3),80.0(C-4),59.3(C-5),36.3(C-6),207.1(C-7),50.7(C-8),44.3(C-9),45.6(C-10),17.5(C-11),30.1(C-12),37.8(C-13),66.2(C-14),53.7(C-15),167.0(C-16),78.3(C-17),19.3(C-18),65.1(C-19),120.1(C-20),143.4(C-21),110.0(C-22),141.4(C-23),17.1(C-24),29.8(C-25),21.5(C-26)。上述NMR数据与文献[6]报道的数据一致，故确定化合物3为柠檬苦素(limonin)。

化合物4白色粉末状固体，mp 228.6～229.7 ℃。ESI-MSm/z455.3[M+H]+,分子式C26H30O7。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:6.65(1H,d,J=8.8 Hz,H-1),6.02(1H,d,J=8.8 Hz,H-2),2.65(1H,dd,J=12.1,2.2 Hz,H-5),2.43(1H,d,J=2.2 Hz,H-6a),2.97(1H,d,J=12.1 Hz,H-6b),2.19(1H,dd,J=9.5,1.2 Hz,H-9),1.81(2H,m,H-11),1.54(1H,dd,J=10.5,1.2 Hz,H-12a),1.62(1H,d,J=11.6 Hz,H-12b),3.72(1H,s,H-15),5.52(1H,s,H-17),1.27(3H,s,H-18),1.47(3H,s,H-19),7.46(1H,s,H-21),6.45(1H,d,J=8.6,H-22),7.49(1H,d,J=8.6,H-23),1.15(3H,s,H-24),1.54(6H,s,H-25,26);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:158.2(C-1),122.1(C-2),167.6(C-3),84.5(C-4),56.6(C-5),39.8(C-6),208.5(C-7),53.2(C-8),48.9(C-9),43.1(C-10),18.0(C-11),32.4(C-12),37.4(C-13),65.5(C-14),53.1(C-15),167.3(C-16),78.1(C-17),19.9(C-18),20.6(C-19),120.5(C-20),142.3(C-21),110.1(C-22),143.1(C-23),16.7(C-24),32.2(C-25),27.0(C-26)。以上数据与文献[7-8]报道一致,故确定化合物4为黄柏酮(obacunone)。

化合物5淡黄色粉末，mp 130.2～131.1 ℃,ESI-MSm/z:199[M]+,分子式C12H9NO2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ:7.58(1H,d,J=2.2 Hz,H-2),7.05(1H,d,J=2.2 Hz,H-3),8.13(1H,d,J=7.2 Hz,H-5),7.62(1H,dd,J=7.6,7.2 Hz,H-6),7.43(1H,dd,J=7.8,7.6 Hz,H-7),7.91(1H,d,J=7.8 Hz,H-8),4.21(3H,s,4-OCH3)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:143.4(C-2),104.2(C-3),159 8(C-4),122.5(C-5),123.4(C-6),129.4(C-7),127.0(C-8),103.3(C-3a),117.9(C-4a),145.1(C-8a),163.5(C-9a),58.9(4-OCH3)。以上数据与文献[9-12]报道一致,故鉴定化合物5为白鲜碱(dictamnine)。

4 α-葡萄糖苷酶抑制活性

4.1 活性测试方法

采用文献方法[13]测试5个化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，实验用酶标仪在96孔板中进行。孔中加入预先用磷酸缓冲溶液(pH 7.4)配制成0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液20 μL和不同浓度的样品溶液20 μL，于37 ℃恒温孵育20 min，然后再在每孔加入底物(2.5 mmol/L PNPG糖苷)20 μL启动反应，于37 ℃恒温继续孵育20 min后，每孔加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL终止反应。用阿卡波糖作为阳性对照，在405 nm的波长处测试吸收度，每组重复3次，按公式(1)计算化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制率，并用Origin7.0软件计算其 IC50。

Inhibition (%)=[1-(Atest-Acontrol)/Ablank]×100

(1)

式中：Atest代表样品吸收度，Acontrol代表对照组吸收度，底物PNPG溶液被等体积的磷酸缓冲溶液代替。Ablank代表空白组吸收度，样品溶液被等体积的磷酸缓冲溶液代替。

4.2 活性测试结果

采用上述方法测定了化合物1～5的α-葡萄糖苷酶抑制活性，实验结果表明，化合物3～5具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，均强于阳性对照品阿卡波糖(IC50=510.93±0.67 mg/L)，结果见表2。

Table 2 α-Glucosidase inhibitory activity of compounds isolated from the petroleum ether extract of Dictamnus dasycarpus

5 结 论

关于白鲜皮化学成分中降糖作用的研究尚未见文献报道。本研究通过色谱分离技术从白鲜皮石油醚部位中分离制备了5个化合物，分别鉴定为二十二烷醇(1)、2,2-二二苯甲基-3,3-二苯基丙酸乙酯(2)、柠檬苦素(3)、黄柏酮(4)和白鲜碱(5)，并采用 PNPG 法评价了其体外抑制α-葡萄糖苷酶的活性。结果表明，化合物2为新化合物，化合物1为首次从白鲜皮中分离得到；从白鲜皮石油醚部位分离得到的柠檬苦素、黄柏酮和白鲜碱均对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用，其IC50均小于阳性对照品阿卡波糖。本实验为研究白鲜皮石油醚部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性及其作为糖尿病治疗药的进一步开发利用提供了科学参考。