基于UFLC-IT-TOF/MS技术分析不同产地黄芪的化学成分

胡诗浩，于心悦，李瑞婷，吴晓霞，杨旭萍，韩昭迪，黄 寅*

(1海口市人民医院药学部,海口 570208;2中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室,南京 210009)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效[1-2]。现代药理学研究表明，黄芪主要含有皂苷、黄酮、氨基酸以及多糖等多种活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血糖、保护肝肾等药理作用[3-6]。黄芪的主产区位于我国甘肃、内蒙古等地，由于各地区海拔、土壤、光照等环境因素的不同，各地区黄芪的化学成分亦有所差别。

目前，有研究利用高效液相色谱法、紫外分光光度法等手段，分析比较了内蒙古、甘肃、山西和吉林等产地黄芪的化学成分，初步证实在各地的黄芪中总皂苷、总黄酮等成分的含量有所不同[7-9]。这些研究为不同产地黄芪的质量评价和控制提供了一定的科学依据。然而，由于技术手段和研究思路的限制，前期研究大多只分析测定了黄芪的几个成分或某一类总提物，未能全面比较不同产地黄芪的化学成分的差异性，所得结果具有一定片面性。对此，本文以甘肃和内蒙古产区的黄芪为研究对象，引入基于超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱联用(UFLC-IT-TOF/MS)的代谢组学方法，采集不同产地黄芪水煎液的LC-MS指纹图谱，运用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)、(非)参数检验等数据挖掘方法，全面分析甘肃和内蒙古黄芪的化学成分差异，为准确鉴定黄芪药材的产地提供潜在的质控标志物(Q-marker)。

1 材 料

1.1 药品与试剂

黄芪药材购自亳州药材市场，其中甘肃(GS)9个批次，内蒙古(NM)6个批次，由安徽中医药大学彭灿副教授鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Beg.var.mongholicus(Bge.) Hisao的干燥根。对照品黄芪甲苷(批号110781-201717)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号111920-201606)、芒柄花素(批号111703-201504)等均购自中国药品生物制品检定所；毛蕊异黄酮(批号DST171108-012，成都德思特生物技术有限公司)；亚油酸(批号L-1376-500MG，美国Sigma-Aldrich公司)。HPLC级甲醇和乙腈(德国Merck公司)；甲酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；超纯水(实验用自制)。

1.2 仪 器

超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱仪(UFLC-IT-TOF/MS，日本Shimadzu公司)；Milli-Q超纯水制备系统(美国Milipore公司)；冻干机(德国Labconco公司);5430R冷冻离心机(德国Eppendorf 公司)。

2 方 法

2.1 样品制备

将15批药材样品粉碎后过40目筛，称取10 g药粉，加超纯水100 mL，煎煮2 h后，收集滤液；滤渣再加超纯水100 mL，再次煎煮2 h，收集滤液；合并两次滤液冻干成粉。取冻干粉适量(相当于生药0.1 g)，精密称定，加入70%甲醇1.0 mL，涡旋(1 min)、超声(10 min)、离心(16 000 r/min，10 min)，取上清液，过0.22 μm滤膜后进样分析。

2.2 色谱条件

选用Waters X Select HSS T3 XP(2.1 mm×100 mm,2.5 μm)色谱柱，以甲醇(A)和0.1 %甲酸的水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，具体梯度如下：0～6 min，1% A；6～7 min，1%～35% A；7～13 min，35% A；13～15 min，35%～50% A；15～17 min，50% A；17～18 min，50%～75% A；18～21 min，75% A；21～22 min，75%～100% A；22～26 min，100% A；26～27 min，100%～1% A；27～30 min，1% A。流速：0.25 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

2.3 质谱条件

离子源为电喷雾(ESI)源，采用正、负离子切换同时检测模式；雾化气流速：1.5 L/min；干燥气气压：104 kPa；检测电压：1.8 kV，离子源入口电压：正极4.5 kV，负极-3.5 kV。曲线脱溶剂管温度和加热模块温度均为200 ℃；离子积聚时间：20 ms；扫描范围：m/z100～1 000。

2.4 数据处理与统计分析

采用Profiling Solution软件(日本Shimadzu公司)对UFLC-IT-TOF/MS采集的原始谱图进行峰提取和峰匹配，所得数据矩阵依次进行扣减空白、填补缺失值、面积归一化处理。所得结果导入Mathematica软件(Ver 11.3,Wolfram,USA)进行统计分析，首先利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)对样品进行模式识别，以变量投影重要性(VIP)反映各个离子对分组的贡献大小。除多元统计分析外，还进行单变量分析，根据每个变量(即离子)是否成正态分布，采用Student′s T Test或Mann-Whitney U Test检验其组间差异的显著性。此外，计算每个离子在两组间的倍数变化(FC)。最终以VIP>1、调整P值(adjustedP)<0.05以及|FC|>1.5为阈值，筛选与不同产地相关的差异离子。

2.5 化学成分鉴定

将差异离子的质荷比、多级碎片等信息与TCMSP(lsp.nwu.edu.cn)、GNPS(gnps.ucsd.edu)等中药化学成分数据库以及文献中黄芪的化学成分信息进行比对，初步鉴定其化学结构；进而购买标准品，通过比对保留时间、准确质量数以及碎片离子，确定差异变量的归属。

2.6 质控样本

为保障方法的可靠性，从15批药材的粉末中各取适量，充分混合后拆分成4份质控(QC)样本，穿插于药材样品中进行样品前处理和仪器分析。

3 结 果

3.1 分析方法可靠性

甘肃和内蒙古黄芪的代表性LC-MS指纹图谱如图1所示。从正、负离子流图可以看出，不同产地的黄芪水煎液的指纹谱整体轮廓较为相似，但个别物质的含量(峰高)有明显区别。原始谱图经Profiling Solution软件进行峰提取和峰匹配，在正、负离子模式下分别识别出622和549个离子，经扣减空白和“80%规则”筛选，分别剩余397和380个离子，整合而成一个19×777的数据矩阵。

Figure 1 Typical ion chromatogram of the water decoctions of Astragalus membranaceus in Gansu Province(GS) and Inner Mongolia Autonomous Region (NM)

为保障数据的可靠性，采用无监督的模式识别方法——主成分分析(PCA)研究了4份QC样本的分布情况，结果如图2-A所示，所有QC样本均得以良好聚集。此外，进一步分析从QC样本中提取出的每一个离子信息的变异情况，发现所有离子的质量精度偏差小于5 mD，保留时间偏移小于0.10 min，峰面积的相对标准偏差(RSD)均低于20%(图2-B)。以上结果表明本研究采用的样品前处理和仪器分析方法稳定、可靠，所得数据可用于进一步分析。

3.2 模式识别与统计分析

通过PCA得分图，除了展现QC样本的分布之外，还能观察到不同产地黄芪药材的聚集情况。本研究中，甘肃产的药材聚集度较高，而内蒙古产的药材分布较为离散，以至于两组之间有一定交叠，这可能是由于PCA是一种无监督的模式识别方法，没有利用到各样本的分组信息。因而，进一步采用有监督的PLS-DA方法分析数据，所得模型参数为R2Y (cum)=0.996，Q2 (cum)=0.605。PLS-DA得分图如图3-A所示，除一个离群点外，甘肃产黄芪与内蒙古产黄芪各自能较好的聚为一类，且两组之间有清晰的分界，说明同一产区的黄芪化学成分较为相似，而不同产地则有明显区别。接着，计算了每个离子的变量投影重要性(VIP)、组间统计学差异以及倍数变化，发现符合VIP >1、adjustedP<0.05和|FC|>1.5的离子个数分别为284、72和57，最后利用Venn图(图3-B)筛选出24个差异离子同时满足上述3个条件。

Figure 2 Data quality assessment by quality control (QC) samples

Figure 3 Differential features screening between GS and NM groups

3.3 差异化学成分鉴定

通过查询数据库、参阅文献[2,10-11]，鉴定出落叶松脂醇、丁香树脂酚、7,3′-二羟基-2′,4′-二甲氧基黄烷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷Ⅳ、维生素B2和亚油酸共计7个差异成分(表1)，分属于木脂素、黄酮、维生素和脂肪酸等4大类。在此基础上，本课题组购买标准品，确证了毛蕊异黄酮、芒柄花素和亚油酸的结构，结果如图4所示。

Table 1 List of 7 differential compounds identified between GS and NM groups

Figure 4 Identification of calycosin,formononetin and linoleic acid in Astragalus membranaceus samples by comparing the extract ion chromatograms and mass spectra with commercial standards

4 讨 论

中药材有效成分的形成、转化与积累除受本身的遗传特性决定外，还与环境因素密切相关。甘肃和内蒙古作为黄芪的两个主要产区，其地理位置与气候特征等环境因素不尽相同。目前，甘肃地区黄芪栽培主要集中在陇西县、岷县等地，位于甘肃省东南部，属黄土高原地区，具有海拔高(1 420～3 941 m)、日照充足、昼夜温差大、年降水量少等特点[12]。内蒙古地区黄芪栽培主要集中在赤峰、包头、呼和浩特等地，平均海拔高度1 000 m左右，土壤形成过程中钙积化强烈，有机质积累较多，其气候特征与甘肃相似，具有昼夜温差大、日照充足、降水变率大等特点[13]。本研究发现，甘肃与内蒙古种植环境的不同确实造成了黄芪中部分化学成分含量的差异，如图5所示，有5种成分在甘肃黄芪中含量较高，包括落叶松树脂醇、丁香树脂酚、7,3′-二羟基-2′,4′-二甲氧基黄烷、维生素B2和亚油酸，而内蒙古黄芪则含有更多的毛蕊异黄酮和芒柄花素。

本研究鉴定出的7个差异性化学成分，均被现代药学研究证明具有重要的药理作用[14-20]。例如，毛蕊异黄酮具有抗纤维化和保护内皮细胞等作用，可能通过抑制TGF-β1诱导的内皮细胞转分化防治糖尿病肾病[15-16]；芒柄花素具有降血压、调节雌激素、调节代谢等活性，而且对女性生殖系恶性肿瘤、泌尿系肿瘤等多种恶性肿瘤的抗肿瘤效应具有广泛性，有望开发为新型广谱抗肿瘤药物[17-18]；维生素B2是体内多种氧化酶系统不可缺少的辅酶，对维持人体正常物质代谢和某些特殊生理功能是不可缺少的[19]；亚油酸则是人体必需的脂肪酸，具有抗氧化、降低血液中的胆固醇、减少冠心病的发生等作用[20-21]。黄芪作为一味中药，其临床疗效的发挥有赖于多种成分药效作用的叠加[2,22]，那么由于产地环境不同所引起的物质基础差异很可能会反映在黄芪的功效作用上。因此，在临床应用中应充分考虑产地因素对黄芪药材的影响，根据具体药材调整剂量、提高疗效。

Figure 5 Distribution charts of 7 differential compounds in Astragalus membranaceus samples from GS and NM

值得注意的是，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷被2015版《中华人民共和国药典》规定为黄芪药材的含量测定项[1]，作为黄芪的主要活性成分，它们已被证实具有降血糖、抗凋亡、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症等多种药理作用[2,23]。在本实验中通过与标准品比对确证检测到这两种成分(保留时间分别为23.5 min和15.1 min)，但是在甘肃和内蒙古产的黄芪中其含量并未见显著差异，说明仅以黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为指标不能有效区分不同产地的黄芪。与之相比，本研究发现的7个差异性化学成分则可以提供更多维度的信息，更有利于全面表征药材的质量。

5 结 论

本研究利用UFLC-IT-TOF/MS技术和模式识别方法，比较分析了甘肃与内蒙古产区黄芪水煎液的化学指纹图谱，发现毛蕊异黄酮、芒柄花素、亚油酸等7个差异性化学成分。初步证实产地的不同会影响黄芪的化学成分，但对于土壤、光照等环境因素如何改变黄芪的化学成分，尚需要进一步研究。本实验为黄芪药材的全面质量评价、科学区分产地以及合理种植栽培提供理论参考。